一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒制造技术

本提供一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，肠道病毒的四个亚型为EV71、CVAl6、CVA6、CVA10。本发明专利技术运用一步法实时荧光定量RT‐PCR技术，采用EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10病毒高度特异的引物和荧光标记探针，通过一个PCR反应即从粪便标本中同时检测出肠道病毒的存在，并同时进行病毒分型鉴定，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。本发明专利技术对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床早期诊断提供工具，为临床治疗方案的制定提供参考依据。可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

A five heavy fluorescent quantitative reagent box for detecting enterovirus

A five fluorescent quantitative reagent kit for the detection of enterovirus is provided. The four subtypes of enterovirus are EV71, CVAl6, CVA6, and CVA10. The invention adopts one-step real-time fluorescence quantitative RT - PCR technology, using the primers and probes of EV and EV71, CVAl6, CVA6, CVA10 virus is highly specific, through a PCR reaction from fecal samples detected in intestinal viruses, and virus subtype identification, than single fluorescence quantitative the PCR method is more convenient and fast, saving cost. The invention can real-time and accurately quantify the detected virus, and provide tools for early clinical diagnosis according to the titer of virus infection, so as to provide reference for the formulation of clinical treatment plan. It can be applied to laboratory emergency diagnosis, rapid screening of enterovirus, clinical diagnosis and epidemiological study of hand foot mouth disease.

【技术实现步骤摘要】
一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒
本专利技术属生物
，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，是一步法五重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便或咽拭子标本中肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)的核酸检测方法，可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
技术介绍
肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，传统上分为脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)、埃柯病毒(Echovirus,Echo)、柯萨奇病毒A、B组(CoxsackievirusA、B,CVA、B)及新型肠道病毒。在最新的肠道病毒分类中，国际病毒分类委员会(ICTV)根据生物学及遗传特性将其分为4个组，分别为肠道病毒A、B、C、D组。至今已报道的肠道病毒血清型超过百种。手足口病(hand，footandmouthdisease，HFMD)是由人类肠道病毒感染引起的，以手、足、口、臀部出现皮疹症状为主要临床症状的常见传染病，主要以轻症为主，但重症及死亡病例也时有报道。根据中国疾病预防控制中心全国法定报告传染病发病、死亡统计的最新数据显示(http://www.chinacdc.cn/tjsj/fdcrbbg/)，自2008年至2016年7月，中国大陆共有15,432,764例手足口病例，其中3,486例死亡。手足口疾病在我国的感染形势依然严峻。以往的大多报道中，导致手足口病的病原体主要为为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CVA16)。而近年来在世界范围内，除EV71和CVA16之外其他肠道病毒引起的手足口病病例及疫情事件越来越多。2008年新加坡CVA6与CVA10感染引起35.3％的手足口病病例；2008年在芬兰爆发主要由CVA6感染引起以指甲脱落为特征的手足口病疫情。2010年，在法国与芬兰，手足口病病例疫情的主要病原体为CVA6及CVA10；2010年在日本与台湾地区，引起手足口病疫情的主要病原体为CVA6；2012年，在印度手足口病疫情的病原体主要为CVA16及CVA6，而EV71及CVA10则很少。肠道病毒的其他类型流行的频率越来越高，在我国的山东、河南、重庆及深圳等地区都有报道。2012年深圳地区由EV71、CVA16、CVA6和CVA10四种病原引起的手足口病总计占到了肠道病毒的89.8％。2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化，CVA6取代EV-71成为杭州地区检出阳性率最高的的肠道病毒，杭州地区由EV71、CVA16、CVA6和CVA10四种病原引起的手足口病总计占到了肠道病毒的85.4％。上述文献报道显示，近年来，国内外手足口病病原谱构成发生较大变化，CVA6及CVA10逐渐成为手足口病主要及重要的病原体。目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而迫切需要开发一种能够检测肠道病毒并对主要的感染型别进行分型的检测试剂。目前肠道病毒检测方法主要包括三类：病毒分离培养、免疫学方法、分子生物学方法。病毒分离培养是病毒性疾病诊断的金标准，但其操作繁琐，检测时间长，且阳性率较低。免疫学方法为传统分型的主要方法，但抗血清的来源很有限，无法满足临床病原诊断的要求。而基于PCR等相关技术的分子生物学方法以其灵敏、快捷等优势得到极大发展。多重实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，涉及一种肠道病毒以及其四个亚型(EV71、CVAl6、CVA6、CVA10)的荧光定量试剂盒，是一种一步法五重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒(EV)阳性对照品、阴性对照品、EV定量标准品1-5号。其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)和引物探针混合液(含EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针)；酶混合液含耐热TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；阴性对照品为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水；EV阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒；EV定量标准品1-5号为浓度1×103copies/ml-1×107copies/ml的内含肠道病毒5’端非转录编码区DNA序列的阳性质粒样品。引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：上游引物EV-F:5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’，下游引物EV-R:5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’，特异性探针EV-P:5’-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’，上游引物EV71-F:5’-GAGYATGATYGARACACGCTG-3’，下游引物EV71-R:5’-CGCTCTRCTRAAGAARCTATC-3’，特异性探针EV71-P:5’-FAM-AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC-BHQ1-3’，上游引物CVA16-F:5’-CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC-3’，下游引物CVA16-R:5’-GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC-3’，特异性探针CVA16-P:5’-VIC-AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT-BHQ1-3’，上游引物CVA6-F:5’-AARCCRGATAGYAGGAAATC-3’，下游引物CVA6-R:5’-GGGGTGGATCACTCAATTTTG-3’，特异性探针CVA6-P:5’-CY5-CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG–BHQ3-3’，上游引物CVA10-F:5’-GAGACTGGACGYGTRCCA-3’，下游引物CVA10-R:5’-GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，特异性探针CVA10-P:5’-TAMRA-CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ2-3’，其中EV、EV71、CVA16、CVA6、CVA10的特异性探针序列5’端分别采用ROX、FAM、VIC、CY5、TAMARA等5种不同荧光基团标记，3’端分别采用与荧光基团对应的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团标记。本专利技术提供的肠道病毒荧光定量试剂盒需于-20℃条件下储存，尽量减少反复冻融；荧光PCR检测混合液需避光条件保存。本专利技术的另一个目的是提供上述检测试剂盒在肠道病毒以及其四个亚型的核酸检测中应用。所述肠道病毒的四个亚型分别为EV71、CVA16、CVA6、CVA10。本专利技术试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，其特征在于，由荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品、肠道病毒定量标准品1‑5号组成，其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液和引物探针混合液，引物探针混合液含EV、EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，阴性对照品为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，肠道病毒阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒，肠道病毒定量标准品1‑5号为浓度：10

【技术特征摘要】
1.一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，其特征在于，由荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品、肠道病毒定量标准品1-5号组成，其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液和引物探针混合液，引物探针混合液含EV、EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针，酶混合液含耐热TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，阴性对照品为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，肠道病毒阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒，肠道病毒定量标准品1-5号为浓度：103copies/ml-1×107copies/ml的内含肠道病毒5’端非转录编码区DNA序列的阳性质粒样品；引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：上游引物EV-F:5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’，下游引物EV-R:5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’，特异性探针EV-P:5’-ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQ2-3’，上游引物EV71-F:5’-GAGYATGATYGARACACGCTG-3’，下游引物EV71-R:5’-CGCTCTRCTRAAGAARCTATC-3’，特异性探针EV71-P:5’-FAM-AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC-BHQ1-3’，上游引物CVA16-F:5’-CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC-3’，下游引物CVA16-R:5’-GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑜，谢国良，崔大伟，楼滨，郑书发，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33