检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒。所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO.1～2所示，该引物可以特异性扩增非典型猪的瘟病毒NS3基因片段。本发明专利技术还提供了一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒和检测非典型猪的瘟病毒的方法，该试剂盒具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低等有益效果。发明专利技术通过上述引物、试剂盒和方法对非典型猪的瘟病毒进行定量检测和确定，可以快速精准的测定目的基因的拷贝数，对APPV的检测鉴定提供了一种技术基础。

Absolute fluorescence quantitative PCR primers and kits for detecting the virus of atypical swine

The invention belongs to the field of biological technology, in particular to an absolute fluorescent quantitative PCR primer and a kit for detecting the plague virus of the atypical pig. The nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 ~ absolute fluorescence quantitative PCR primers and the detection of atypical swine plague virus 2 shows, the primers can be atypical swine plague virus NS3 gene fragment specific amplification. The invention also provides a kit for detecting the atypical swine plague virus and a method for detecting the atypical swine pestivirus. The kit has the advantages of fast and efficient, convenient operation, high specificity, high sensitivity, simple identification and low cost. Through the above primers, kits and methods, we can quantitatively detect and determine the atypical swine plague virus. We can quickly and accurately measure the copy number of target genes, and provide a technical basis for the detection and identification of APPV.

【技术实现步骤摘要】
检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒。
技术介绍
众所周知，黄病毒科瘟病毒是感染偶蹄动物的重要病原体之一。其中瘟病毒除了包括具有代表性的猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhoeavirus，BVDV)之外，近年来，还分别于2007发现了Bungowannah病毒，于2012年发现了菊头蝠瘟病毒(Rhinolophusaffinisbatspestivirus，RaPestV-1)，于2014年发现了挪威鼠瘟病毒，更是于2015年发现了一种新型的非典型猪的瘟病毒(Anatypicalporcinepestivirus，APPV)。APPV是2015年由Hause在美国农场中的猪体内首先发现，该研究称对猪的血清样品进行检测分析发现一种新型病毒，它与RaPV有68％的相似率，剩下25％～28％与其他的瘟病毒相似。因此，该病毒被命名为一种新型的非典型猪的瘟病毒(Anatypicalporcinepestivirus)，简称“APPV”。该研究结果也表明这种新型的非典型猪的瘟病毒在美国猪的体内广泛分布。随后，为了探索APPV在欧洲猪群中的流行情况，德国也采集了部分当地养猪场内猪的样品进行分析研究，发现APPV在德国猪群中也呈现出普遍流行的状况。之后，有研究者通过APPV疫苗去接种未感染怀孕母猪，发现这些初产母猪的头胎仔猪大部分患有仔猪先天性震颤，除此之外，还有其他相关研究也表明APPV与仔猪的先天性震颤有关。而仔猪先天性震颤是发生在新生仔猪身上的一种普遍现象，于1922年被首次发现，发病时通常表现出局部或全身的肌肉震颤特征，轻微症状表现为在耳朵和后腿呈现局部颤动。严重症状表现为全身震颤、站立或行走困难，最终由于哺乳护理困难死于饥饿或直接淘汰。在中国，仔猪先天性震颤导致仔猪的百分百淘汰率对养猪业造成了巨大的经济损失。有一些报道认为仔猪先天性震颤的病因是母猪妊娠后期的营养不足导致的胎儿发育不全，或是由猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等病毒病所引起的，但究竟是那种病因导致的仔猪先天性震颤，目前尚未有确切的结论。但近年来的研究表明，在APPV和仔猪先天性震颤之间存在着明显的影响关系，APPV可能是导致仔猪先天性震颤的重要原因之一。至今，在中国尚未有关于APPV研究的相关报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物。本专利技术的另一目的在于提供一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述绝对荧光定量PCR引物。本专利技术的再一目的在于提供上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物，包含引物APPV_NS3-F、引物APPV_NS3-R，其核苷酸序列如下所示：引物APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT-3’；引物APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG-3’；一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，包括上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物；所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒优选包括如下组分：2×OneStepSYBRGreenMix、OneStepSYBRGreenEnzymeMix、上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和无RNA酶水；所述的试剂盒还包括阳性标准品和阴性对照；所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和检测非典型猪的病毒的试剂盒在检测非典型猪的瘟病毒中的应用；所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的；一种检测非典型猪的瘟病毒的方法，包含如下步骤：(1)提取猪组织或血清样本中APPV病毒的RNA；(2)将步骤(1)提取的APPV病毒的RNA反转录为cDNA；(3)根据APPV的保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(2)中反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段；其中，普通PCR引物对为：APPV_NS3-F和APPV_NS3-R；(4)步骤(3)扩增得到的目的片段经胶回收纯化后连接PMD-18-T载体，得到重组质粒；(5)以步骤(4)得到的重组质粒为模板，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(6)以步骤(5)扩增得到的PCR扩增产物为模板，利用体外转录试剂盒将其转录为RNA；(7)将步骤(6)转录得到的RNA倍比稀释后作为标准品，测算出起始RNA拷贝数；(8)以待测样品的RNA及各梯度稀释的标准品分别作为反应模板进行荧光定量PCR反应，根据标准品荧光定量PCR标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，即为APPV的含量；步骤(2)中所述的反转录优选为采用随机引物和反转录MLV酶将RNA反转录为cDNA；步骤(2)中所述的反转录进一步优选为：配制RNA引物混合液反应体系：步骤(1)提取的APPV病毒的RNA(作为模板)5.75μL，随机引物1μL，共计6.75μL；70℃水浴10min，冰浴2min；再配制反转录体系：RNA引物混合液6.75μL，5×反转录buffer2μL，10μMdNTP0.5μL，RNase抑制剂0.25μL，MLV酶0.5μL，共计10μL；30℃水浴10min，42℃水浴1h，得到cDNA；反转录后的cDNA可保存于-20℃；步骤(3)中所述的PCR扩增的体系优选为：PremixTaq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，引物APPV_NS3-F和APPV_NS3-R各0.5μL，cDNA模板5μL；步骤(3)中所述的PCR扩增的反应程序优选为：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；步骤(5)中所述的APPV_NS3-T7-F的核苷酸序列为：引物APPV_NS3-T7-F：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGGAAAGGCCGAGTGGG；步骤(5)中所述的PCR扩增的体系优选为：PremixTaq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R各0.5μL，质粒模板5μL；步骤(5)中所述的PCR扩增的反应程序优选为：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应体系为：2×OneStepSYBRGreenMix缓冲液10μL，OneStepSYBRGreenEnzymeMix1μL，荧光定量PCR引物各0.4μL，无RNA酶水6.2μL，RNA模板2μL；步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应程序为：50℃3min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环；步骤(8)中所述的待测样品和标准品在同一扩增体系和反应中进行荧光定量PCR扩增，保证了标准品和样品的同扩增体系和同反应；步骤(8)中所述的荧光定量PCR的引物为APPV_NS3-F和APPV_NS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物，其特征在于包含引物APPV_NS3‑F、引物APPV_NS3‑R，其核苷酸序列如下所示：引物APPV_NS3‑F：5’‑CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT‑3’；引物APPV_NS3‑R：5’‑ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物，其特征在于包含引物APPV_NS3-F、引物APPV_NS3-R，其核苷酸序列如下所示：引物APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT-3’；引物APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG-3’。2.一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物。3.根据权利要求2所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，其特征在于包括如下组分：2×OneStepSYBRGreenMix、OneStepSYBRGreenEnzymeMix、上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和无RNA酶水。4.权利要求1所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和权利要求2或3所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒在检测非典型猪的瘟病毒中的应用。5.一种检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)提取猪组织或血清样本中APPV病毒的RNA；(2)将步骤(1)提取的APPV病毒的RNA反转录为cDNA；(3)根据APPV的保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(2)中反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段；其中，普通PCR引物对为：APPV_NS3-F和APPV_NS3-R；(4)步骤(3)扩增得到的目的片段经胶回收后连接PMD-18-T载体，得到重组质粒；(5)以步骤(4)得到的重组质粒为模板，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(6)以步骤(5)扩增得到的PCR扩增产物为模板，利用体外转录试剂盒将其转录为RNA；(7)将步骤(6)转录得到的RNA倍比稀释后作为标准品，测算出起始RNA拷贝数；(8)以待测样品的RNA及各梯度稀释的标准品分别作为反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，朱梦娇，邓少锋，范双旗，张静远，李军，丁红星，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44