一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针制造技术

本发明专利技术涉及一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。本发明专利技术包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和条件优化、检测结果判定和应用。本发明专利技术建立的检测鹅多瘤病毒的实时荧光定量PCR的方法，在检测鹅多瘤病毒上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测35.4个拷贝，可用于检测临床样本中鹅多瘤病毒的感染检测。

A primer and probe for real time fluorescence quantitative PCR detection of goose multi tumor virus

The present invention relates to a primer and probe of real time fluorescence quantitative PCR detection of goose multi tumor virus, which belongs to the field of animal infectious disease. The invention includes the design of specific primers and probe sequences, the construction of standard plasmids, the establishment and optimization of real-time fluorescence quantitative PCR amplification, the determination and application of detection results. Real time fluorescent quantitative PCR method for detection of goose polyoma virus of the invention of the establishment, in the detection of goose virus on high sensitivity, good stability and strong specificity and good reproducibility, the lowest detection of 35.4 copies, can be used for the detection of clinical samples, goose polyoma virus infection detection.

【技术实现步骤摘要】
一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针
本专利技术涉及一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。
技术介绍
鹅出血性多瘤病毒（goosehemorrhagicpolyomavirus，GHPV）可导致鹅群发生鹅出血性肾炎和肠炎（hemorrhagicnephritisandenteritisofgoose,HNEG），主要感染4-10周龄鹅群。鹅感染GHPV主要病变为出血性肠炎、出血性肾炎、腹水和水肿等症状，该病于1969年首次报道，随后在欧洲地区多地鹅群中发现存在该病感染。GHPY属于无囊膜环状DNA病毒，全基因长度约为5.2kb，编码5个主要的开放阅读框（openreadingframe，ORF）：3个假定蛋白（VP1、VP2和VP3）与两个T抗原蛋白（大T抗原和小T抗原）。一般认为，鸭群对GHPY感染不敏感；但2008年首次报道GHPY可跨种感染番鸭和半番鸭；2012年姜甜甜等报道中国北京鸭可感染GHPY；2016年万春和（本专利专利技术人）等报道樱桃谷鸭可感染GHPY（樱桃谷鸭源鹅出血性多瘤病毒VP3基因的克隆与序列分析.2017,44(4):980-985.）。因此，建立一种快速检测水禽（鸭和鹅）中GHPY感染的方法十分重要。实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。常见的实时荧光定量PCR方法主要有两大类：SYBRGreenⅠ法和TaqMan探针法。SYBRGreenⅠ法是指在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。目前，国内外检测鹅多瘤病毒的方法有PCR方法（GuerinJ,GelfiJ,DuboisL,etal.Anovelpolyomavirus(goosehemorrhagicpolyomavirus)istheagentofhemorrhagicnephritisenteritisofgeese[J].JVirol,2000,74(10):4523-4529.）和基于SYBRGreenⅠ染料法（LeonO,CorrandL,BichTN,etal.GooseHemorrhagicpolyomavirusdetectioningeeseusingreal-timePCRassay[J].AvianDis,2013,57(4):797-799.）的实时荧光定量PCR方法的报道。但是，SYBRGreenⅠ法中的染料能够与双链结合，当扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样才能收集到信号，即SYBRGreenⅠ染料法特异性不强，只要和双链DNA结合都会发光，容易导致结果的假阳性和误判，给流行病学的监测造成一定的困扰。而TaqMan探针法较SYBRGreenⅠ染料法相比，除了引物另外设置一个特异性的探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团；当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。TaqMan探针法较SYBRGreenⅠ染料法在病原监测上结果更准确特异，已在多种病原的监测上被广泛应用。但当前尚未见基于TaqMan探针法检测鹅多瘤病毒的引物、探针及其方法相关研究报道，本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是填补现有技术中尚未见实时荧光定量PCR检测鹅多瘤病毒的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测35.4个拷贝，可用于对临床样本中鹅多瘤病毒的分子流行病学调查，为明确鹅多瘤病毒的分子流行病学特点提供检测方法和手段。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：上游引物GHPY-F：5’-GCTTCAGATGATGATATGG-3’，下游引物GHPY-R：5’-CACCCGGAACAAATATTAC-3’；所述探针序列GHPY-P为：5’-AAGGATCTTGCACTTGCACGTTC-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。所述引物和探针用于鹅多瘤病毒的实时荧光定量PCR检测方法为：（1）定量标准质粒的构建与制备以提取的鹅多瘤病毒核酸DNA为模板，用上游引物GHPY-F3（引物序列为：5’-TGAATGCCTGTTAATCTTGTA-3’）和下游引物GHPY-R3（引物序列为：5’-CTATACACAGGGTCAATCT-3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为491bp）。上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。使用PCR扩增试剂（2×PCRMasterMIX）推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMasterMix反应液25μL、上下游引物(GHPY-F3和GHPY-R3)（引物浓度为10μmol·L-1）各1μL、提取的核酸模板DNA2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min后进入循环，94℃变性50s、54℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10min。反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用UniversalDNA纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1SimpleCloningKit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5α克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，进行双酶切鉴定符合预期后，送由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，将序列测定结果经BLAST分析明确其为鹅多瘤病毒序列，将该阳性重组质粒作为标准品质粒（T-GHPY）。(2)实时荧光定量PCR反应体系和程序：以鹅多瘤病毒阳性标准品（T-GHPY）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为3.54×106、3.54×105、3.54×104、3.54×103、3.54×102和3.54×101拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64℃）、引物（GHPY-F、GHPY-R）浓度（2.5，5.0，10和20μmol/L）和探针（GHPY-P）浓度（1.25、2.5、5和10μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为鹅多瘤病毒感染阳性。建立的鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法优化出的25μL最佳反应体系为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：上游引物GHPY‑F：5’‑ GCTTCAGATGATGATATGG ‑3’，下游引物GHPY‑R：5’‑ CACCCGGAACAAATATTAC ‑3’；所述探针序列GHPY‑P为： 5’‑ AAGGATCTTGCACTTGCACGTTC ‑3’，其5’‑端标记荧光报告基团FAM，3’‑端标记荧光淬灭基团Eclipse。

【技术特征摘要】
1.一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：上游引物GHPY-F：5’-GCTTCAGATGATGATATGG-3’，下游引物GHPY-R：5’-CACCCGGAACAAATATTAC-3’；所述探针序列GH...

【专利技术属性】
技术研发人员：万春和，黄瑜，程龙飞，陈翠腾，傅光华，施少华，陈红梅，傅秋玲，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35