紫甘蓝MDH基因、引物对及用途制造技术

本发明专利技术公开了紫甘蓝MDH基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术公开了紫甘蓝MDH基因扩增引物对，为如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列。本发明专利技术公开了紫甘蓝MDH基因半定量PCR扩增引物对，为如SEQ ID NO：4和5所示的碱基序列。本发明专利技术公开了紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，为如SEQ ID NO：6和7所示的碱基序列。本发明专利技术公开了一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒。本发明专利技术公开了内参基因或半定量PCR扩增引物对或实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。本发明专利技术提高了紫甘蓝基因表达时的检测效率、可信度，以及紫甘蓝基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

MDH gene, primer pair and use of purple cabbage

The invention discloses a purple cabbage MDH gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. The invention discloses a purple cabbage MDH gene amplification primer pairs, such as the SEQ sequence ID NO:2 and shown in figure 3. The invention discloses a purple cabbage MDH gene primers for semi quantitative PCR, such as SEQ sequence ID NO:4 and shown in figure 5. The invention discloses a purple cabbage reference gene real-time quantitative primer pairs, such as the nucleotide sequence of SEQ ID NO:6 and shown in figure 7. The present invention discloses a kit for detecting the relative expression level of the functional gene of purple cabbage. The invention discloses a reference gene or semi quantitative PCR primers or primers for real-time fluorescence quantitative gene function of purple cabbage cabbage in different stages and different varieties of purple cabbage in the use of the relative expression level detection. The invention improves the detection efficiency and reliability of the expression of purple cabbage, and the stability, reliability and repeatability of the expression analysis of purple cabbage.

【技术实现步骤摘要】
紫甘蓝MDH基因、引物对及用途
本专利技术属于分子生物学
，涉及紫甘蓝MDH基因、引物对及用途，特别涉及紫甘蓝MDH基因序列的克隆方法以及其用作内参基因的半定量表达和荧光定量表达的引物序列。
技术介绍
紫甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataf.rubraDC.)为十字花科芸薹属可食用性蔬菜。紫甘蓝富含维生素C、维生素E、维生素B，以及花青素等，备受人们的欢迎。此外，紫甘蓝结球紧实，色泽艳丽，抗寒。耐热，产量高，耐贮运，是很受欢迎的一种蔬菜。目前，紫甘蓝在工业、科研、医药、食品加工等行业中的应用逐渐受到重视，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示紫甘蓝基因表达和调控的机理。但是，目前紫甘蓝的分子生物学研究还在起步阶段。关于紫甘蓝的内参基因的研究还未见报道。缺乏内参基因，难以实现对基因表达水平的校正和标准化，也不能对基因在不同条件和发育时期下的表达水平进行研究和比较，大大阻碍了紫甘蓝中各种基因的表达特性研究和基因功能分析研究。目前基因的表达分析有主要有两种方法。一是半定量PCR技术，一般是用一个表达稳定的看家基因做参照标准来观察目标基因的表达情况，最后通过电泳图估计参照亮度一致(可看作是表达的细胞数一致)情况下，来确定目标基因的表达。半定量PCR快速、简单，可以广泛地应用。另外一种基因表达分析的方法是实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、重复性好且高通量，已经成为植物科学领域中进行基因组研究的常用技术之一。但是与传统的半定量PCR技术相比，实时荧光定量PCR不能监测扩增产物的大小、且实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。所以，在实际应用中，这两种技术各有用途，有时候还需要结合进行使用。无论是半定量PCR还是实时荧光定量PCR技术，在其分析过程中，RNA的质量和产量、反转录效率的差异等都会对目的基因表达分析的准确性产生影响。因此均需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，从而减小检测样本之间的差异。理想的内参基因应该在所有的细胞中和生理状态下都能较稳定地表达，可以完全用于不同类型的样品。常用的内参基因是多是在组织器官中基本可以稳定地表达的看家基因(如ACT、GAPDH和18SrRNA等)。而近年来的研究发现，这些常用内参基因在某些条件下均存在缺陷。因此，其他的非看家基因(如MDH、TIP41和热激蛋白hsp90基因等)作为新内参基因的进行挖掘已然成为重中之重。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种紫甘蓝中既可以用于做半定量分析还没有用于实时荧光定量分析的内参基因及其序列，并同时提供了利用该基因为基础设计的半定量和定量分析PCR引物。为此，本专利技术提供的技术方案为：紫甘蓝MDH基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。紫甘蓝MDH基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。紫甘蓝MDH基因半定量PCR扩增引物对，所述半定量PC扩增引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序列和如SEQIDNO：5所示的碱基序列。紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对为：如SEQIDNO：6所示的碱基序列和如SEQIDNO：7所示的碱基序列。一种用于紫甘蓝功能基因相对表达水平检测的试剂盒，其包含所述的引物对。所述的内参基因或所述的半定量PCR扩增引物对或所述的实时荧光定量引物对于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期以及紫甘蓝不同品种中相对表达水平检测方面的用途。本专利技术的紫甘蓝的MDH基因片段分别作为半定量和实时荧光定量的内参基因，应用于紫甘蓝功能基因在紫甘蓝不同发育时期、以及不同紫甘蓝品种中相对表达水平检测的应用。本专利技术克隆了紫甘蓝中MDH的基因编码区。设计了相应的特异性基因定量引物，建立了半定量分析的方法和基于SYBGGreenI染料技术的实时荧光定量PCR方法，从而为紫甘蓝中基因表达水平分析提供了有用的方法。本专利技术所获得的紫甘蓝的内参基因MDH的核苷酸序列可以作为研究紫甘蓝中功能基因在紫甘蓝不同发育时期、以及不同紫甘蓝品种中表达相对水平的内参基因，不仅解决了现有紫甘蓝定量PCR检测中没有内参基因的现状；而且所涉及的引物特异性强，不但可以用作半定量分析，还可以用实时荧光定量PCR分析，大大提高了紫甘蓝中基因表达分析检测的稳定性和可靠性。本专利技术至少包括以下有益效果：1.本专利技术首次克隆得到紫甘蓝的MDH基因的编码序列；2.本专利技术首次提出在紫甘蓝定量PCR检测中建立通用的内参基因；3.本专利技术提供的MDH基因及其相应的检测引物，既可以做半定量分析，又可以做实时荧光定量PCR分析，可以根据实际需求进行选择，大大提高了其应用范围。4.本专利技术首次提出将紫甘蓝MDH基因作为内参基因用于紫甘蓝在不同品种和不同发育时期的半定量PCR检测和实时荧光定量PCR检测，解决了紫甘蓝定量PCR检测中没有内参基因的现状，可以用于检测紫甘蓝中其他功能基因的表达水平；5.本专利技术提出的检测引物具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及紫甘蓝基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1是本专利技术实施例1的1％琼脂糖电泳图；图2是本专利技术实施例2的1％琼脂糖电泳图；图3是本专利技术实施例3的实时荧光定量PCR扩增曲线图；图4是本专利技术实施例3的实时荧光定量PCR溶解曲线图；图5是本专利技术实施例4的实时荧光定量PCR扩增曲线图；图6是本专利技术实施例4的实时荧光定量PCR的Cq值分布图；图7是本专利技术实施例5的实时荧光定量PCR的Cq值分布图；图8是本专利技术实施例6的实时荧光定量PCR的Cq值分布图；图9是本专利技术实施例7的实时荧光定量PCR的Cq值分布图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术提供紫甘蓝MDH基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。紫甘蓝MDH基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。紫甘蓝MDH基因的核苷酸序列的克隆方法，包括提取紫甘蓝总RNA，反转录并以产物第一链cDNA为模板，利用利用该扩增引物对：引物MDH-F1和MDH-R1进行PCR扩增MDH基因的编码区序列，PCR产物经回收、连接、转化大肠杆菌并筛选得到阳性克隆，最后经测序验证。所述PCR的扩增反应条件如下：94℃预变性3min，【98℃变性10s、62℃退火30s、68℃延伸1min】30个循环，68℃再延伸5min。紫甘蓝MDH基因半定量PCR扩增引物对，所述半定量PC扩增引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序列和如SEQIDNO：5所示的碱基序列。本专利技术还提供一种半定量PCR扩增MDH基因部分序列的方法，包括以产物第一链cDNA为模板进行半定量P本文档来自技高网...

【技术保护点】
紫甘蓝MDH基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.紫甘蓝MDH基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.紫甘蓝MDH基因扩增引物对，所述扩增引物对为：如SEQIDNO：2所示的碱基序列和如SEQIDNO：3所示的碱基序列。3.紫甘蓝MDH基因半定量PCR扩增引物对，所述半定量PC扩增引物对为：如SEQIDNO：4所示的碱基序列和如SEQIDNO：5所示的碱基序列。4.紫甘蓝内参基因实时荧光定量引物对，所述实时...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴杰，王志东，王啸晨，张洁，孙倩倩，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11