本发明专利技术涉及了参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a、其编码基因及其功能。属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开了栀子类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a基因的开放阅读框序列以及其编码的氨基酸序列。本发明专利技术基于转录组学筛选获得CCD4a基因，通过构建pET28a‑CCD4a原核表达载体，以玉米黄质为底物在体外验证CCD4a的功能。结果证明CCD4a具有类胡萝卜素裂解双加氧酶的功能，为西红花苷生源途径的解析及合成生物学研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
一种参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选及功能验证
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及西红花苷生物合成基因的筛选及功能验证方法。
技术介绍
西红花苷为胡萝卜素类化合物，主要在西红花柱头和栀子果实中积累。西红花苷在抑制癌症、提高记忆力、抗忧郁、治疗心血管疾病等方面，具有一定的疗效。鉴于西红花苷的药用和经济价值，其所属植物西红花常被加了很多光环，被誉为药材中的“红色黄金”，零售价高达价格2,000至7,000￡/kg。我国传统中药栀子(GardeniajasminoidesEllis)也富含西红花苷，据报道西红花苷I和西红花苷II在果肉中含量高达27.54mgg-1。同时，栀子的化学和药理研究较为深入，栀子资源丰富，果实较西红花更易于取材，所以我们认为栀子是西红花苷合成调控研究的潜在理想植物。近年来，西红花苷的生物合成途径研究受到广泛关注，参与西红花苷合成途径关键酶虽然基本清楚，但这些关键酶基因都是多基因家族，具体行使功能的基因未知。对西红花苷的生物合成研究多涉及下游CCD、ALDH和UGT基因，其中CCD研究最为广泛，多个基因已被验证功能，例如CsCCD1a、CsCCD1b、CsCCD2、CaCCD2、CsCCD4a、CsCCD4b、CsCCD4c。然而，仅CsCCD2和CaCCD2被证实参与西红花苷的合成。栀子中CCD基因是否参与西红花苷合成仍未知，因此十分有必要挖掘栀子CCD基因并验证其功能，为西红花苷的合成奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种参与西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及其编码的蛋白质。本专利技术的另一目的在于提供一种栀子西红花苷合成关键酶基因的筛选方法。本专利技术的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因CCD4a的功能验证方法。本专利技术提供的CCD4a基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，或其突变序列。本专利技术提供的CCD4a基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或其突变序列。本专利技术目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于转录组的栀子西红花苷合成关键酶基因筛选，步骤如下：1)UPLC检测栀子叶片、绿果和红果中西红花苷的含量。2)基于Illumina测序平台，并依照测序平台的标准操作流程，构建栀子叶片、绿果和红果CDNA文库及上机测序，对测序结果进行组装和注释。分析差异基因表达，初筛西红花苷合成途径关键酶蛋白序列。3)采用qRT-PCR检测候选基因表达水平，构建进化树分析栀子与其他物种候选蛋白之间的进化关系，进一步筛选西红花苷合成途径关键酶基因。技术方案二：关键酶基因CCD4a的功能验证。采用大肠杆菌表达体系，以玉米黄质为底物，体外鉴定类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a的功能。本专利技术公开了西红花苷生物合成基因CCD4a筛选及功能验证的一整套完善体系，验证CCD4a具有类胡萝卜素裂解双加氧酶的功能，能够催化玉米黄质，对阐明西红花苷合成途径提供分子基础，同时具有重大的应用价值，可通过基因工程技术手段生物合成西红花苷。附图说明图1：西红花苷I和西红花苷II的UPLC检测图2：候选西红花苷途径基因表达谱图3：候选CCDs、ALDHs和UGTs的qRT-PCR分析(actin为内参)图4：候选CCDs，ALDHs和UGTs的qRT-PCR分析(GAPDH为内参)图5：候选CCDs、ALDHs和UGTs进化关系图6：CCD4a的体外功能验证具体实施方式以下结合实例详细说明本专利技术。实施是为更好的理解本专利技术，但不限定于本专利技术。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。实施例1栀子绿果、红果和叶片中西红花苷含量检测1.1实验方法将叶片、绿果和红果样品真空冷冻干燥，研磨器粉碎过筛，每份样品精确称量0.25g于三角瓶中，加入50％色谱级甲醇25mL超声提取45分钟。提取后，小心加入少量50％甲醇补平重量损失。提取液过滤后过0.22μm滤膜获得供试样品。标准品配制：精确称量标准品西红花苷I和西红花苷II制作混合标品，各自浓度分别为0.035mg/ml西红花苷I和0.015mg/ml西红花苷II。色谱条件：采用WatersBEH-C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱温35℃，以乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：0-6min，5-12％A；6-25min，12-48％A。流速0.3mL/min，进样量2μL，检测波长为440nm。1.2结果与分析叶片中没有检测到西红花苷成分，西红花苷I和西红花苷II仅在果实中积累，说明二者的积累具有组织特异性。从含量上看，随着果实的成熟，西红花苷I和西红花苷II含量逐渐增加，二者增加倍数略有不同，西红花苷I在红果中的含量约为绿果的三倍，而西红花苷II在红果中的含量约为绿果的7倍(图1)。西红花苷在不同部位的差异分布与关键酶基因表达的一致性是我们筛选西红花苷合成途径基因的主要筛选原则。实施例2栀子绿果、红果和叶片的转录组测序、组装和注释2.1实验方法2.1.1栀子RNA提取、CDNA文库构建与上机栀子植株种植于中国医学科学院药用植物研究所重庆分所植物园内，于10月份采集叶和果实，收集后立刻洗净并用液氮速冻后储存于-80℃冰箱中。采用QIAGENRNeasyPlusMiniKit(74134)进行提取，具体操作参照其说明书。提取的总RNA经凝胶电泳检测RNA完整性，经NanoDrop微量荧光分光光度计检测RNA浓度，总量应大于3.5微克。通过Agilent2100Bioanalyzer检测，RIN(RNAintegritynumbe)值应＞1.7。1μg质量完好的RNA用于文库构建，具体步骤参照说明书(UltraTMRNALibraryPrepKitfor)。2.1.2原始数据的过滤拼接和注释对rawreads序列进行过滤，获得高质量cleanreads。使用Trinity组装软件进行序列的从头组装。组装后的序列经cd-hit-est软件去冗余，获得unigenes。通过blastx程序将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、KO(KEGGOrthologdatabase)、GO(GeneOntology)和Pfam(Proteinfamily)，获得与目标Unigene序列具有最高序列相似性的蛋白，从而获得该Unigene的蛋白功能注释信息。2.2结果与分析2.2.1测序数据的组装和注释采用IlluminaHiSeq2000测序平台对栀子叶片、绿果和红果的转录组进行测序，各样品测序情况如表1。用TRINITY软件对序列进行拼接，共获得156,658contigs，平均长度为906bp，N50为1,632bp。用CD-HIT软件进一步去冗余获得141,665unigenes(合计122,469,676bp)，平均长度为864bp，N50为1,574bp(表2)。将蛋白序列比对到Uniprot、Pfam、KEGG和GO数据库，注释到的基因数量与比例如表3。表1不同样品测序情况小结表2测序数据量及组装情况表3不同数据库注释比例实施例3西红花苷合成途径关键酶基因的鉴定和差异表达分析3.1实验方法以NCBI下载的其他物种西红花苷途径关键酶氨基酸序列作本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种栀子中类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a基因，其特征在于其是如下的基因(a)或基因(b)：基因(a)：具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因。基因(b)：具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有类胡萝卜素裂解双加氧酶功能的基因。
【技术特征摘要】
1.一种栀子中类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a基因，其特征在于其是如下的基因(a)或基因(b)：基因(a)：具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列的基因。基因(b)：具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有类胡萝卜素裂解双加氧酶功能的基因。2.一种栀子中类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD4a基因编码的蛋白质，其特征在于其是如下的蛋白质(a)或基因(b)：蛋白质(a)：具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质。蛋白质(b)：具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有类胡萝卜素裂解双加氧酶功能的蛋白质。3.一种利用高通量测序技术，筛选栀子中西红花苷合成关键酶基因的方法，具体步骤如下：1)UPLC检测栀子叶片、绿果和红果中西红花苷的含量。2)基于Illumina测序平台，并依照测序平台的标准操作流程，构建栀子叶片、绿果和红果cDNA文库及上机测序，对测序结果进行组装和注释。分析差异基因表达，初筛西红花苷合成途径关键酶蛋白序列。3)采用qRT-PCR检测候选基因表达水平，构建进化树分析栀子与其他物种候选蛋白之间的进化关系，进一步筛选西红花苷合成途径关键酶基因。4.栀子CCD4a的功能验证方法，具体步骤如下：将pET28a-CCD4a载体与pACCAR25ΔcrtX载体共转化到大肠杆菌BL21(DE3)...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋经元，季爱加，贾静，徐志超，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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