具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用，通过体外抑制活性、益生特性测定和主成分分析筛选得到一株具有双重降糖靶点且抑制活力较高的植物乳杆菌ST‑2，其CFS提取物对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制率为13.442％；对二肽基肽酶‑IV活性的抑制率为21.525％。实验表明ST‑2对于不同来源的α‑葡萄糖苷酶、二肽基肽酶‑IV具有一定抑制活力；还能够显著降低Ⅱ型糖尿病鼠的羰基化血红蛋白值，因此对于延缓糖尿病人餐后碳水化合物的吸收及降低餐后血糖上升具有极大应用价值。把ST‑2制成活菌数高的冻干菌粉，活菌数高达冻干前的89％，另，ST‑2还具有良好的发酵效果。将其应用于乳制品生产或作为食品配料添加至功能性食品中，对于糖尿病、肥胖能够起到良好的预防及干预效果。

Lactobacillus plantarum with dual hypoglycemic target and its application

The invention discloses a dual hypoglycemic target of Lactobacillus plantarum and its application, inhibitory activity in vitro, probiotic properties determination and principal component analysis, we screened a strain with double targets and hypoglycemic inhibitory activity of Lactobacillus plantarum ST 2, the extract of CFS inhibition on the enzyme activity of alpha grape rate 13.442%; two inhibition of dipeptidyl peptidase IV activity rate was 21.525%. Experimental results show that the ST 2 for alpha glucosidase, two different sources of dipeptidyl peptidase IV has certain inhibitory activity; also can significantly reduce the carbonylation of hemoglobin in type II diabetes mellitus rats value, so to reduce and postprandial blood glucose rise has great application value of carbohydrate absorption delaying diabetes after meal. The freeze-dried powder made of 2 ST high number of viable bacteria, viable count up to 89% before lyophilization, the other 2, ST also has good fermentation effect. It can be applied to dairy production or as a food ingredient added to functional foods, and it can play a good preventive and intervention effect for diabetes and obesity.

【技术实现步骤摘要】
具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用。
技术介绍
糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足(I型)或胰岛素抵抗(II型)引起的一种代谢紊乱性疾病，其特点是慢性高血糖症。目前糖尿病已成为一种主要的疾病，对人类的生活和健康造成了巨大的损害。根据世界卫生组织的数据显示，至2017年，中国糖尿病的患病率已居世界首位，人数约1.1亿，约占中国成年人总数的十分之一。依照现有趋势，到2040年，我国患者将超过1.5亿，糖尿病死亡率将大于艾滋病、结核病和疟疾死亡率的总和。因此针对糖尿病的药物及功能性食品成为了当前研究的热点。糖尿病人的日常饮食管理对于糖尿病人的血糖控制和生存质量至关重要。控制餐后高血糖对于治疗早期糖尿病具有极其重要的意义,其中控制餐后碳水化合物的吸收是一种降低餐后高血糖的有效治疗方法。食物中的碳水化合物在肠道内主要以单糖的形式被吸收。人体摄入的淀粉等多糖物质被唾液和胰α-淀粉酶降解生成寡糖及二糖后，还需要在肠道粘膜α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能被吸收。因此，α-葡萄糖苷酶的抑制成为餐后血糖控制以及药物筛选的一个有效靶点。除此以外，人体中还存在着两种内源性肠促胰岛激素：促胰岛素释放多肽(GIP)和胰高血糖素样肽(GLP-1)。它们可以促进胰岛素的分泌，维持血糖平衡。其中GLP-1易被血液中存在二肽基肽酶-IV(DPP-IV)迅速降解。因此，DPP-IV的抑制成为促进胰岛素分泌，维持血糖平衡的一个重要靶点。目前针对这些靶点筛选的抑制剂一般只具有单个靶点的抑制功能，同时具有双重抑制靶点的抑制剂较为少见。益生菌(probiotics)是一类对人和动物等宿主有益的微生物。益生菌具有多种保健作用：1.能维持微生态平衡和肠管机能；2.有抗菌作用；3.能改善肝功能；4.益生菌能使肠道减少对胆固醇的吸收，并能将一部分胆固醇转变成胆酸盐排出体外；5.增强免疫功能和抗肿瘤病。目前大量研究表明，益生菌具有减少糖尿病发病率的潜力，但是人们对于益生菌作为糖尿病治疗剂的研究还是很少。尤其对于具有双重靶点抑制能力益生菌报道就更为少见。而且益生菌类的制剂在被人或动物食用后，只有在大量活菌顺利抵达、黏附并成功定植于回肠和结肠部位时，才能对宿主发挥益生作用。在这一消化过程中，口腔中的环境，胃部的低pH值环境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物质就成为阻碍益生菌进入肠道的第一道天然屏障。因此，菌体细胞对胃肠道环境具有较高的耐受性对于发挥益生作用至关重要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，该菌具有显著的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，以及体外抑制二肽基肽酶-IV活性的能力，因而对降低血糖，以及提高胰岛素水平具有显著的效果。本专利技术还有一个目的是提供一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的应用，通过将筛选出的植物乳杆菌作为食品配料添加至功能性食品中，能够对糖尿病人的日常饮食起到良好的干预效果。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。一种有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，主要包括以下步骤：步骤1、对各菌株分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定，从而筛选出对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV均具有较高抑制率的菌株；步骤2、对步骤1筛选出的菌株做16S-rDNA基因测序，以确定菌种；步骤3、对已确定菌种的菌株进行益生特性测定，并筛选出益生特性最好的菌株，即得所述具有双重降糖靶点的植物乳杆菌；其中，所述益生特性测定包括：耐酸性试验、耐胆盐试验、对模拟口腔和胃肠道的耐受性、体外模拟益生菌的消化试验和对HT-29细胞的黏附性。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述步骤1前，需要对各菌株的细胞代谢物和细胞内容物进行提取，然后用所述细胞代谢物和细胞内容物分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述细胞代谢物和细胞内容物的提取方法分别为：细胞代谢物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于35-40℃孵育10-15h，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞代谢物；细胞内容物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞内容物。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.1M，pH值为6.8。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以破碎3-5s的脉冲破碎10-15min。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，步骤1中对α-葡萄糖苷酶的抑制测定主要包括以下步骤：步骤1-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL的p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷PNPG，20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，于37℃培养8-12min，再加入0.01U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，在37℃反应10-20min，最后加入100μL的0.1M的碳酸钠溶液终止反应，用酶标仪于405nm处测反应液的吸光值；步骤1-2、用阿卡波糖做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照；步骤1-3、计算相对抑制率，筛选出对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较高的菌株。优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，步骤1中对二肽基肽酶-IV的抑制测定主要包括以下步骤：步骤2-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，45-55μL缓冲液，0.5-1.5μL酶，于37℃避光培养8-12min，再加入45-55μL缓冲液，1-3μL物质，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值；步骤2-2、用西格列汀做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照；步骤2-3、计算相对抑制率，筛选出对二肽基肽酶-IV的抑制活性较高的菌株。一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌在制备降糖功能性食品中的应用。本专利技术至少包括以下有益效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，其中，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。

【技术特征摘要】
1.一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，其中，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum。2.一种如权利要求1所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，其中，主要包括以下步骤：步骤1、对各菌株分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定，从而筛选出对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV均具有较高抑制率的菌株；步骤2、对步骤1筛选出的菌株做16S-rDNA基因测序，以确定菌种；步骤3、对已确定菌种的菌株进行益生特性测定，并筛选出益生特性最好的菌株，即得所述具有双重降糖靶点的植物乳杆菌；其中，所述益生特性测定包括：耐酸性试验、耐胆盐试验、对模拟口腔和胃肠道的耐受性、体外模拟益生菌的消化试验和对HT-29细胞的黏附性。3.如权利要求2所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，其中，所述步骤1前，需要对各菌株的细胞代谢物和细胞内容物进行提取，然后用所述细胞代谢物和细胞内容物分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定。4.如权利要求3所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，其中，所述细胞代谢物和细胞内容物的提取方法分别为：细胞代谢物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于35-40℃孵育10-15h，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞代谢物；细胞内容物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹭，吕加平，王芬，张书文，逄晓阳，芦晶，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11