黄病毒复制子制造技术

本发明专利技术尤其提供改善的复制子和编码它们的载体,其中所述的复制子提供被编码的蛋白质的持续表达。这些复制子包含编码黄病毒复制酶和异源蛋白质的序列,其中所述的编码异源蛋白质的序列的侧翼是用于改善效力的分隔序列。由本发明专利技术提供的这些核酸,包括由本发明专利技术提供的自我复制的RNA在内，可用于蛋白质表达的方法中,例如用于疫苗(例如用于免疫接种方法)以及治疗性蛋白质例如抗体的表达(例如用于治疗方法)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】黄病毒复制子专利
本专利技术尤其涉及用于异源蛋白质表达的改善的复制子和编码复制子的载体以及有关的使用它们的方法。专利技术背景自我复制的核醣核酸(RNA),例如来源于病毒复制子的自我复制的核醣核酸，可用于表达蛋白质,例如用于多种目的的异源蛋白质,例如表达治疗性蛋白质和表达用于疫苗的抗原。这样的复制子的期望的性质是持续表达所述的蛋白质的能力。WO99/28487A1(昆士兰卫生部)和Varnavski等人,Virology255,366-375(1999)公开了编码(+)链自我复制的RNA的核酸序列，其包括编码Kunjin病毒复制酶的序列、编码黄病毒核心蛋白质的一部分和黄病毒5’非翻译区(UTR)的蛋白质编码序列。能够把所述的复制子包装成病毒复制子颗粒(VRP)并且用作疫苗。Herd等人,“RecombinantKunjinvirusrepliconvaccinesinduceprotectiveT-cellimmunityagainsthumanpapillomavirus16E7-expressingtumour”,Virology319:237-248(2004)公开了编码(+)链自我复制的RNA的核酸序列，其包括编码Kunjin病毒复制酶的序列和编码将要被用作疫苗的人乳头状瘤病毒(HPV)表位的蛋白质编码序列。Alcaraz-Estrada等人,“Constructionofself-replicatingsubgenomicWestNilevirusrepliconsforscreeningantiviralcompounds”,MethodsMol.Biol.1030:283-299(2013)公开了编码(+)链自我复制的RNA的核酸序列,其包括编码西尼罗河病毒株956复制酶的序列和报道基因。WO2006/086838A1(QueenslandInst.Med.Res.)公开了(+)链自我复制的RNA,其包括编码Kunjin病毒复制酶的序列和在肿瘤治疗中使用的GM-CSF蛋白质的蛋白质编码序列。所述的'838专利申请也公开了西尼罗河病毒和黄病毒的用途。Queiroz等人,“Constructionofyellowfevervirussubgenomicrepliconsbyyeast-basedhomologousrecombinationcloningtechnique”,AnaisdaAcademiaBrasileiradeCiências85:159-168(2010)公开了编码(+)链自我复制的RNA的核酸序列,其包含编码黄病毒株170复制酶的序列和报道基因。Jones等人,“Constructionandapplicationsofyellowfevervirusreplicons”,Virology331:247-259(2005)公开了编码各种报道基因的黄病毒复制子。专利技术概述本专利技术尤其提供改善的复制子和编码它们的载体,其中所述的复制子提供被编码的蛋白质的持续表达。这些复制子包含编码黄病毒复制酶和异源蛋白质的序列。所述的编码异源蛋白质的序列的两侧是用于改善效力的分隔序列。由本专利技术提供的这些核酸,包括由本专利技术提供的自我复制的RNA在内，可用于蛋白质表达的方法中,例如用于疫苗(例如用于免疫接种方法)以及治疗性蛋白质例如抗体的表达(例如用于治疗方法)。附图简述通过下列实施例进一步举例说明本专利技术,不应该把所述实施例解释为限定性的。所述的实施例涉及下列附图:图1是复制子WNV001和Y030的图示。WNV001包含用于在体外转录之前模板线性化的XbaI位点；采用核酸外切酶把模板链上不需要的核苷酸除掉而产生失控模板。Y030包含用于在体外转录之前线性化的SapI位点并且在消化之后立刻产生失控(runoff)模板。UTR＝非翻译区,C*＝在用来保留环化序列的工程化缺失之后，剩余的壳体结构蛋白序列。E*＝在用来保留NS1信号序列的工程化缺失之后，剩余的包封结构蛋白序列。NS1-NS5＝非结构WNV蛋白质。图2A-2C提供来自BHK细胞中WNV001RNA的免疫组织化学分析的显微照片。简单来说,采用4μg的RNA把BHK细胞电穿孔；在电穿孔以后48小时，将细胞固定,透化以及分析WNV抗原的存在。使用来自表达WNV-NS1的甲病毒复制子(A609)的RNA作为阳性对照。图2A:采用对免疫组织化学(IHC)阳性反应的A609RNA电穿孔的细胞。图2B:采用WNV001RNA电穿孔的细胞显示很少的对IHC阳性反应的细胞。图2C:模拟品电穿孔不产生IHC阳性的细胞。图3是概括关于BHK细胞中Y030RNA的流式细胞术分析的柱状图。简单来说,采用1μg的RNA把BHK细胞电穿孔并且在电穿孔以后24小时，分析YFV抗原的存在。进行了模拟品的电穿孔作为阴性对照。图4A-4B提供关于不同的WNV复制子和转录方案的示意图。图4A:紧接在WNV001的3’UTR之后添加有义或反义肝炎Δ病毒核酶(S-HDVR或AS-HDVR)序列以产生分别地包含所述的有义或反义HDVR的第二代复制子WNV006和WNV007。图4B:所述的核酶序列的添加消除了对在模板链上进行外切核糖核酸酶补齐的需要。图4B是由Shi等人Virology296,213-233(2002)改编而来。图5是举例说明添加HDVR显著地改善WNV复制子效力的柱状图。简单来说,把0.25μg–4μg的WNV001、WNV006或WNV007RNA电穿孔到BHK细胞中。在电穿孔以后48小时，经由流式细胞术分析细胞中WNV抗原的存在。结果指示:在测试的所有范围内，包含在WNV006中的有义HDVR产生最有效力的WNV复制子RNA。图6是用来评估S-HDVR对YFV复制子效力的影响的复制子的示意图。这两种复制子都在结构缺失区之内包含GFP与融合在框内的FLAG标记报道基因。图7是举例说明添加HDV核酶不增强YFV复制子效力的柱状图。简言之，把0.1μg–1μg的Y037或Y040RNA电穿孔到BHK细胞中。在电穿孔以后24小时，经由流式细胞术分析细胞中YFV抗原的存在。结果指示:有义HDVR对YFV效力不具有显著的影响。图8提供驱动黄病毒复制子RNA的转录的修饰的T7启动子。图8A:添加到WNV008或Y042复制子以产生经由ATP启动的复制子RNA的多种启动子修饰。在启动转录处的核苷酸以粗体呈现,并且黄病毒的真正的5’UTR的第一个核苷酸是带下划线的。OL＝重叠启动子–启动子的最后一个核苷酸与黄病毒5’UTR序列的第一个核苷酸相重叠。*WNV008等同于WNV006，其具有存在于结构缺失区中的沉默突变以产生AflII克隆位点。图8B:在体外转录之后，使用修饰的启动子在相同的体外转录下产生的WNVRNA的产率。驱动WNV008转录的常规的T7启动子f6.5启动子产生最多的RNA。驱动WNV017和WNV026转录的修饰的启动子具有显著减小的RNA产率。驱动WNV027和WNV028转录的修饰的启动子使RNA产率减小了大约0.66-0.75倍。RNA产率对WNV008的RNA产率归一化。图8C:在体外转录之后，使用修饰的启动子在相同的体外转录条件下产生的YFV复本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸,其包含编码(+)链自我复制的RNA的序列,所述的自我复制的RNA包含编码黄病毒复制酶的序列和编码异源蛋白质的序列,所述的编码异源蛋白质的序列被布置在至少两个侧翼分隔序列之间,并且所述的自我复制的RNA缺乏能够形成病毒颗粒的病毒结构蛋白质的编码序列,其中所述的黄病毒复制酶是:(a)西尼罗河病毒(WNV)复制酶,其中WNV选自由下列组成的组:WNV NY99,WN NY 2000‑crow3356,HNY1999,NY99flamingo38299,IS98STD,goose‑Hungary/03,Italy1998Equine,RO9750,VLG4,LEIV‑Vlg99‑27889,PaH001,PaAn001,Eg101,Chin‑01,Sarafend,B956(WNFCG),goshawk‑Hungary/04,LEIV‑Krnd88‑190,Nea Santa‑Greece2010,Goshawk‑Hungary/04,Greece/2012/Kavala.39.1,Italy/2013/Rovigo/32.1,Austria/2008‑gh,更特别地其中病毒株选自WNV NY99,WN NY 2000‑crow3356或HNY1999；或(b)黄热病毒(YFV)复制酶，其中YFV选自由下列组成的组:17D疫苗株、Asibi株、乌干达481、安哥拉71、17D‑204、17DD、17D‑213、乌干达2010、88/1999；更特别地其中病毒株是17D疫苗株或Asibi株。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.27 EP 15157068.61.分离的核酸,其包含编码(+)链自我复制的RNA的序列,所述的自我复制的RNA包含编码黄病毒复制酶的序列和编码异源蛋白质的序列,所述的编码异源蛋白质的序列被布置在至少两个侧翼分隔序列之间,并且所述的自我复制的RNA缺乏能够形成病毒颗粒的病毒结构蛋白质的编码序列,其中所述的黄病毒复制酶是:(a)西尼罗河病毒(WNV)复制酶,其中WNV选自由下列组成的组:WNVNY99,WNNY2000-crow3356,HNY1999,NY99flamingo38299,IS98STD,goose-Hungary/03,Italy1998Equine,RO9750,VLG4,LEIV-Vlg99-27889,PaH001,PaAn001,Eg101,Chin-01,Sarafend,B956(WNFCG),goshawk-Hungary/04,LEIV-Krnd88-190,NeaSanta-Greece2010,Goshawk-Hungary/04,Greece/2012/Kavala.39.1,Italy/2013/Rovigo/32.1,Austria/2008-gh,更特别地其中病毒株选自WNVNY99,WNNY2000-crow3356或HNY1999；或(b)黄热病毒(YFV)复制酶，其中YFV选自由下列组成的组:17D疫苗株、Asibi株、乌干达481、安哥拉71、17D-204、17DD、17D-213、乌干达2010、88/1999；更特别地其中病毒株是17D疫苗株或Asibi株。2.权利要求1所述的核酸,其中所述的复制酶包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:4具有至少60％同源性的氨基酸序列。3.前面的权利要求中任意一项所述的核酸,其中所述的分隔序列是病毒2A序列。4.前面的权利要求中任意一项所述的核酸,其中至少两个侧翼分隔序列不重组。5.前面的权利要求中任意一项所述的核酸,其中所述的自我复制的RNA的合成由选自由下列组成的组的启动子驱动:T7、SPC6、CMV或前述中任意一种的功能性片段。6.前面的权利要求中任意一项所述的核酸,其中所述的核酸包括自我复制的RNA下游的用于产生功能性3’UTR的序列。7.权利要求6所述的核酸,其中所述的用于产生功能性3’UTR的序列编码核酶。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：C·J·哈根，P·W·玛森，P·沙希尼安，D·于，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH