一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途。所述DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，除5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列外的序列均来源于黄热病毒减毒株。所述重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与所述DNA分子的序列相同。本发明专利技术的DNA分子可用于构建重组病毒，从而获得能够有效预防黄热病毒感染的疫苗。

DNA molecule and recombinant virus and preparation method and application thereof

The invention relates to the technical field of biology, and discloses a DNA molecule and a recombinant virus and a preparation method and an application thereof. The DNA molecule contains series connected 5 'non encoding region sequence, capsid protein encoding sequence, 5' end is connected with a stop codon sequence of the internal ribosome entry site sequence corresponding to the sequence of DNA, membrane protein precursor sequence, encoding envelope protein encoding sequence, non structural protein encoding sequences and 3 \non encoding region sequence, the sequence in the 5 'end is connected with the DNA sequence of stop codon sequences of internal ribosome entry site sequence corresponding to the outside are derived from the yellow fever virus attenuated strain. The genomic RNA of the recombinant virus corresponds to a sequence of cDNA identical to the sequence of the DNA molecule. The DNA molecule of the invention can be used to construct the recombinant virus, which can effectively prevent the yellow fever virus vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途
本专利技术属于生物
，涉及一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途，具体地，涉及一种DNA分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用以及含有所述重组病毒的疫苗。
技术介绍
黄热病(YellowFever，YF)，是一种由黄热病毒(Yellowfevervirus，YFV)引起的、对人类和非人类灵长类具有高度致死性的出血性疾病。黄热病毒属黄病毒科，黄病毒属。其基因组为单股正链RNA，长度约为11kb，5’端包含1型帽子结构，中间为单一开放阅读框，3’端为不含PolyA的UTR区域。通过经典帽子结构起始的翻译途径，YF17D单一ORF编码一多聚蛋白，包含三个结构蛋白(衣壳蛋白C、膜和膜蛋白前体prM、包膜蛋白E)和七个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。黄热病由蚊虫传播，主要流行于非洲和南美洲，每年大约有20万感染病例的报道，其中90％发生在非洲。人感染黄热病毒以后会产生一系列症状包括：发热，恶心，呕吐等，进一步发展为多器官衰竭，出血最终出现死亡。目前，针对黄热病仍然缺乏特效的治疗手段，疫苗接种是最有效的预防病毒感染的措施。黄热减毒活疫苗YF17D是公认的为最安全有效的减毒活疫苗之一，被广泛使用，到目前为止已经超过5亿人次接种使用。YF17D具有较高的免疫效价，单次接种能够在90％到99％接种者体内诱导中和性抗体的产生，提供98％的保护效果，并且持续至少10年时间。虽然黄热减毒活疫苗YF17D安全有效，但是越来越多的报道指出，接种该疫苗以后会引起一系列副作用，包括发热，头痛，接种区域红疹等。更为严重的还会较低几率地引起内脏嗜性疾病和神经系统副作用疾病，对接种者的生命安全造成威胁。因此，研发一种新的更加安全的黄热减毒活疫苗具有重要的公共卫生意义和经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够用于制备预防黄热病毒感染的疫苗的DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途。为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种DNA分子，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。内部核糖体进入位点(InternalRibosomEntrySite，IRES)是一段特异RNA序列，能够结合核糖体，诱导蛋白翻译。在本专利技术的一种优选实施方式中，本专利技术的专利技术人通过反向遗传学技术将IRES整合入黄热病毒减毒株基因组内部，获得了一株高度减毒，并具有较好免疫效果的黄热疫苗株。第二方面，本专利技术提供了一种制备第一方面所述的DNA分子的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列。第三方面，本专利技术提供了含有第一方面所述的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。第四方面，本专利技术提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与第一方面所述的DNA分子的序列相同。第五方面，本专利技术提供了一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列。第六方面，本专利技术提供了一种疫苗，该疫苗的活性成分为上述重组病毒。第七方面，本专利技术提供了上述DNA分子和/或重组病毒在制备用于预防黄热病毒感染的疫苗中的应用。第八方面，本专利技术提供了一种预防黄热病毒感染的方法，该方法包括为受试者接种上述疫苗。本专利技术的DNA分子可用于构建重组病毒，从而获得能够有效预防黄热病毒感染的疫苗。本专利技术提供的重组病毒具有如下多方面的优点：(1)充分减毒，安全性很高；(2)减毒特征稳定，遗传稳定性好，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)能诱导产生针对黄热病毒的免疫应答。综上所述，本专利技术的重组病毒对预防黄热病毒感染具有良好的应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为黄热减毒疫苗株YF17D和重组病毒的全长RNA对应的cDNA的结构示意图；图2为实施例1的步骤三中琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，Maker：DL2000；图3为实施例2所述的间接免疫荧光的结果；图4为实施例3所述的空斑试验的结果；图5为实施例4所述的重组黄热病毒在不同细胞内的增殖特征的测试结果；图6为实施例5所述的各代重组黄热病毒液空斑试验的测试结果；图7为实施例6所述的重组黄热病毒的神经毒力特征的测试结果；图8为实施例9所述的重组黄热病毒的免疫原性的测试结果。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。第一方面，本专利技术提供的DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。其中，本专利技术中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(RNA)构建某蛋白的编码序列(DNA)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于黄热病毒的序列是指与黄热病毒的基因序列具有90％以上(优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。本专利技术中，对所述终止密码子序列没有特别的要求，可以为TAG、TAA或TGA。优选情况下，所述终止密码子序列为TAA。本专利技术中，所述内部核糖体进入位点序列可以为各种病毒的内部核糖体进入位点序列，优选来源于脑心肌炎病毒。所述脑心肌炎病毒可以为野生型毒株。根据本专利技术的优选实施方式，所述内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列如SEQIDNO:2所示。内部核糖体进入位点序列(IRES)是一段特异的RNA序列，能够结合核糖体，诱导蛋白翻译。本专利技术的专利技术人发现，通过使用该特异的序列能够有效地减弱黄热病毒减毒株的毒力。本专利技术中，所述黄热病毒减毒株为黄热减毒疫苗株YF17D。本专利技术中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列可以分别来源于同一基因型的黄热本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中，所述内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列来源于野生型脑心肌炎病毒，优选地，所述内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其中，所述黄热病毒减毒株为黄热减毒疫苗株YF17D。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。5.一种制备权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦成峰，李晓峰，王洪江，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11