使用含有病毒和细胞结合区域的分子增强病毒介导的DNA转移的方法技术

一种提高逆转录病毒转导造血细胞和其它细胞的效率的方法，该方法包括在存在纤连蛋白或纤连蛋白片段时感染细胞。纤连蛋白和纤连蛋白片段明显增强逆转录病毒介导的基因转移进细胞，特别是造血细胞包括定向祖细胞和初级造血干细胞。本发明专利技术还提供利用增强的基因转移造血细胞群体和用于增强逆转录病毒介导的ＤＮＡ转移进细胞的新型构建体进行体细胞基因治疗的改进方法及其应用。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1996年9月30日，申请号为96198553.4的、专利技术名称和本专利技术相同的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术一般地说是涉及提高病毒转导细胞效率的方法，更具体地说是涉及利用含有一个病毒结合区域和一个细胞结合区域的分子如多肽来增强病毒介导的基因转移进细胞的方法。
技术介绍
对于许多人类疾病分子基础理解的进展和基因转移技术的进步，导致了最近发展针对严重遗传疾病的体细胞基因治疗方案的努力。目前，有希望用于人基因治疗的候选疾病包括那些有一种酶或其它蛋白损伤或缺失而酶或蛋白的水平又不需要精确调节的疾病，特别是那些是组成调节的疾病以及损伤见于病人骨髓中的疾病。 例如，基因治疗的一个候选疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺陷，它会导致恶性复合免疫缺陷症(SCID)。在ADA缺陷病人的骨髓细胞中酶很少或检测不到。但是，ADA缺陷已用匹配骨髓移植得到了治愈。ADA正常细胞对ADA缺陷细胞有选择优势，一般能使病人的骨髓种群恢复。 骨髓细胞是体细胞基因治疗的很好目标，因为骨髓组织易于在体外操作并含有种群恢复细胞。另外，人脐带血也已被证明含有大量的初级祖细胞。基因成功地转移进造血干细胞(长期种群恢复细胞)可导致在这些细胞的后代中所显示的多种疾病的终身治愈。 基因转移进种群恢复干细胞和在其中的基因长期表达已由许多研究者在鼠模型中获得了成功。但是，在大型动物如狗和灵长动物的体内实验中，只获得有限的成功，这很大程度上是因为初级造血干细胞感染的低效率。目前的基因转移技术在用于人体方案时由于几个因素其局限性被进一步复杂化，这些因素包括存在于成人骨髓(ABM)中的干细胞的低数目、缺乏纯化这些细胞的合适方法和这种初级细胞在细胞循环中的低份额。 在使用骨髓细胞的鼠和大动物实验两组中，人们已经注意到最成功的方案使用靶细胞和逆转录病毒生产细胞系的协同培养。而且，多数FDA批准的人体基因转移实验靠重组逆转录病毒载体进行基因转导。重组逆转录病毒载体对基因治疗是理想的，因为它们能将外源DNA有效地转移进并精确而稳定地整合到细胞DNA中。这类载体含有用于基因转移的外源DNA，并被进一步修饰以去除病毒的病原性。由于这些修饰，病毒生产一般使用逆转录病毒包装细胞来完成。但是，对于临床基因治疗来说，因为考虑到生物安全性和质量控制，更需要的是无细胞转导。不幸的是，基因有效地转移进造血细胞如干细胞在不与病毒生产细胞协同培养时一般是不可能的。 最近，实验显示通过在感染时将靶细胞与基质细胞接触能提高基因转移效率。基质细胞是造血微环境(HM)中的一种主要成分。HM包括巨噬细胞、基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞和由多种特定的粘附分子组成的复杂的胞外基质(ECM)所形成的有机网络。ECM分子如层粘连蛋白、胶原蛋白、血小板反应蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和纤连蛋白为造血细胞和生长因子两者提供锚定位点。基质对逆转录病毒感染的促进作用的机制还不清楚，但已知有时当造血细胞与HM的细胞直接接触时，会发生造血细胞的增殖和分化的生理调节。 将基因有效地转移进长期种群恢复造血干细胞和其它细胞仍存在问题，目前这阻碍了基因转移技术在造血性和其它疾病的治愈治疗中的广泛应用。这就迫切需要一种能有效地将遗传物质转移进哺乳动物细胞但却没有过去方法的危险性和局限性的方法，本专利技术满足了这些需求。 专利技术简述 简而言之，本专利技术的一个优选实施方案提供了一种提高逆转录病毒载体转导造血细胞的频率的方法。该方法包括，用复制缺陷型重组逆转录病毒载体在存在基本上纯的纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的条件下感染活的造血细胞，所用的纤连蛋白或纤连蛋白片段能有效地提高逆转录病毒细胞转导的频率。纤连蛋白和/或纤连蛋白片段可从自然产生的物质中获得，或合成获得(如通过重组遗传工程技术或化学合成技术)，或从自然产生物质和合成物质的组合中获得。另外，应当理解本专利技术中使用的纤连蛋白多肽或多肽组可包括自然产生的纤连蛋白氨基酸序列的突变，但按照本专利技术这种突变应提供具有完成增强转导所需的粘附特性的功能多肽。 本专利技术的另一个优选实施方案提供生产已被转导的造血细胞的方法，包括用携带外源DNA的复制缺陷型重组逆转录病毒在存在固定的纤连蛋白、固定的纤连蛋白片段或它们的固定的混合物的条件下感染活的造血细胞，其中所用固定物的量足以有效地提高逆转录病毒转导细胞的频率。 本专利技术的另一个优选实施方案提供改进的细胞移植方法。该方法包括以下步骤从动物供体获得活的造血细胞；用重组逆转录病毒载体感染造血细胞来产生被转导的活的造血细胞，感染在存在固定形式的并且能有效提高转导效率的纤连蛋白和/或其片段时进行；将转导的活造血细胞移植物引入动物受体。在一种优选模式中感染细胞可被导入供体自身。 本专利技术的另一个优选实施方案提供适用于细胞移植方案的已被转导的脐带血细胞的获得方法。该方法包括用复制缺陷型重组逆转录病毒载体在存在有效量的固定的纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的条件下感染来自脐带血的造血细胞，纤连蛋白和纤连蛋白片段用来提高逆转录病毒载体转导造血细胞的频率。本专利技术还包括用此方法可获得的来自脐带血的活的已被转导的细胞群体，以及细胞移植方法，该方法包括将被转导的细胞群体用作细胞移植物导入动物。 根据本专利技术的上述实施方案更具体的方面，所用的纤连蛋白或纤连蛋白片段应含有提供纤连蛋白肝素II结合区域的逆转录病毒结合活性的第一氨基酸序列，和提供纤连蛋白CS-1区域的细胞结合活性的第二氨基酸序列。同时使用这两个纤连蛋白的结合区域已被证明能够非常明显地提高逆转录病毒转导靶细胞的效率。 本专利技术的另一个优选实施方案提供生产一种构建体的方法，该构建体用于提高逆转录病毒载体转导预先确定的靶细胞的效率。该方法包括将一个能与所说靶细胞结合的配体同含有提供纤连蛋白肝素II结合区域的逆转录病毒结合活性的氨基酸序列的多肽共价偶联的步骤。本专利技术还包括涉及使用这些构建体来提高逆转录病毒载体转导预先确定的靶细胞的频率和将其用于利用被转导细胞的移植方案的方法。 本专利技术的另一个优选实施方案提供使一定量的病毒定位的方法，包括在存在有效量的固定纤连蛋白或含有纤连蛋白肝素II结合区域的病毒结合活性的纤连蛋白片段时，将含有病毒培养基温育来使一定量的病毒定位。 本专利技术的另外的优选实施方案一般提供含有基本上纯的和/或固定的纤连蛋白或其片段的已被转导的活造血细胞和其它细胞培养物，以及用于逆转录病毒介导的DNA转移进细胞的试剂盒，见下文的进一步介绍。 本专利技术的更优选的实施方案提供获得已被逆转录病毒转导的活细胞群体的方法，包括在存在有效量的固定物质如多肽时用逆转录病毒感染细胞，其中固定物质包括 与细胞结合的配体和 与逆转录病毒结合的配体，以此将逆转录病毒和细胞协同定位并提高细胞的转导效率。我们更奇怪地发现这种过程在缺少或至少基本上缺少溴化己二甲铵(也称为1，5-二甲基-二氨杂十一亚甲基多N-甲溴化物)时可以更好地进行，溴化己二甲铵在此以前是为了提高转导效率而用于基因转移程序。但是，奇怪的是，在本专利技术的协同定位介导的基因转移过程中溴化己二甲铵的存在被发现降低而不是提高转导效率。因此，本专利技术更优选的方法是在缺少溴化己二甲铵或其它能在不含协同定位物质的相似过程如相应协同培养过程中提高转导效率的试剂时进行。所产生的改良的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用逆转录病毒转导Ｔ细胞的方法，包括在存在如下物质时用逆转录病毒感染细胞，该物质包含一种与Ｔ细胞结合的配体和一种与逆转录病毒结合的配体，用来使逆转录病毒和细胞协同定位并提高细胞被转导的效率。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DA威廉斯，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究及科技有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]