一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，该方法包括以下步骤：提取脑心肌炎病毒总ＲＮＡ；ＲＴ－ＰＣＲ方法分段扩增其全长ｃＤＮＡ，并分别建立亚克隆；用双酶切的方法将各段ｃＤＮＡ依次定向克隆至低拷贝质粒载体中，即得脑心肌炎病毒感染性克隆。本发明专利技术方法的操作难度较小，可控性强，能够获得稳定的脑心肌炎病毒感染性克隆，因而，为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制提供了有效的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法。
技术介绍
脑心肌炎是猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或 心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病，由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus， EMCV)引起。EMCV的宿主范围很广， 在多种啮齿类动物、野生动物和灵长类动物均有发现，人也可感染， 但大多数不出现任何症状。猪是感染EMCV最广泛、最严重的动物， 除能引起仔猪致死性心肌炎和脑炎外，还能引起母猪繁殖障碍。目前国内对猪脑心肌炎尚无有效的治疗药物和疫苗，主要靠综合 性防制措施加以预防。由于EMCV在猪和人之间有密切联系，病毒在 猪体内可引起持续感染，而猪的组织器官又是人体组织器官移植的重 要来源，因此对该病毒的研究越来越受到关注。EMCV属微RNA病毒科心肌病毒属成员，其基因组为单股正链 RNA,在复制过程中不形成DNA中间体，而大多数基因工程操作技 术都是在DNA分子水平上进行操作，对EMCV的分子病毒学研究因此 受到限制。随着RNA病毒全长感染性cDNA克隆技术的建立，研究者 可以有效利用病毒的全长cDNA为模板，体外转录出感染性RNA,以 拯救RNA病毒。感染性克隆就是指在细菌质粒中含有病毒全基因组的 cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染 性。感染性克隆提供的全长cDNA模板具有基因型稳定、易操作的特 点，使在基因组水平上研究RNA病毒的单个基因和点突变成为可能， 在研究病毒致病力、病毒各蛋白的功能和病毒复制，甚至在阐明病毒致病机理以及疫苗研制等方面都是十分有用的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供， 为脑心肌炎病毒的分子病毒学研究和疫苗的研制等提供有效的工具。本专利技术构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，包括以下步骤(1) 改造低拷贝质粒载体，使其只含有构建感染性克隆所需的 酶切位点；(2) 提取脑心肌炎病毒的总RNA;(3) 用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA， 获得的三个片段的cDNA两端分别含有不同的酶切位点；(4) 将三个片段的cDNA分别建立亚克隆；(5) 用双酶切的方法将三个片段的cDNA依次定向克隆至改造的 低拷贝质粒载体中，得到含有脑心肌炎病毒全长cDNA的脑心肌炎病 毒感染性克隆。其中，用RT-PCR方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长cDNA 时，在脑心肌炎病毒的5'端非翻译区前加入T7 RNA聚合酶启动子核 心序列，亦能够通过定点突变形成新的酶切位点，作为感染性克隆的 遗传标记，以利于其鉴定。本专利技术构建脑心肌炎病毒的方法分三个片段扩增病毒的cDNA，所扩增的片段相对较短，能够更好地保证所扩增片段序列的保真性， 同时也降低了长片段扩增的操作难度；釆用双酶切定向克隆，使连接 的效率和准确性大大提高；在5'非翻译区前加入的T7 RNA聚合酶启动子核心序列能够保证感染性克隆在体外转录时产生高丰度高质量 的mRNA，大大提高了转染的成功率。因此用本专利技术方法所构建的脑 心肌炎病毒感染性克隆非常稳定，由该感染性克隆拯救出的脑心肌炎 病毒具有侵染性，且拯救病毒的生长特性和在模式动物上的致病性与 其亲本病毒具有较高的一致性。本专利技术方法操作难度较小，可控性较强，所获得的稳定的脑心肌 炎病毒感染性克隆使在病毒基因组上进行分子生物学操作变得简单 易行，从而使在感染性克隆基础上以突变、置换、插入、缺失等手段 对脑心肌炎病毒进行基因功能研究成为可能，同时为新型病毒活载体 疫苗的研制提供了必要的平台。附图说明图1感染性克隆p WSKB JC3/w全长质粒的构建方案和简略步骤图2BJC3三个片段A、 B、 C的RT-PCR扩增产物图3 rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞上产生的细胞病变图4rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定图5 rVBJC3 W感染BHK-21细胞的间接免疫荧光检测结果 图6 rVBJC3W和BJC3在BHK-21细胞中的生长动力学曲线 图7 rVBJC3W和BJC3的小鼠存活曲线图中1、 rVBJC3W RT-PCR产物；2、 BJC3 RT-PCR产物；3、 rVBJC3W RT-PCR后五coRI酶切产物；4、 BJC3 RT-PCR后五coRI酶 切产物；5、 RNA对照；6、水对照具体实施例方式以下实施例以猪脑心肌炎病毒BJC3为例说明本专利技术，但不用来 限制本专利技术的范围。实施例l低拷贝质粒载体的改造根据低拷贝质粒载体pWSK29的全序列和QuikChange Multi Site-directed Mutagenesis Kit ( Stratagene,丹麦)的使用说明书，设计 1对回文引物Spe-Upper和Spe-Lower突变掉3 5 3 6位的Spe I位点，设计 1对回文引物BssH-Upper和BssH-Lower突变掉5124位的II位点。 根据PRRSV Nsp2基因的一段无义序列设计引物，在上游引物 pNSP2-F的5，端依次加上BMHlI和C7a I两个酶切位点，在下游引物 pNSP2-R的5，端依次加上&sH II和5^/z I两个酶切位点，用PrimeSTAR HS DNA Polymerase ( Takara，大连)扩增此片段后以 ^^/n单酶切，同时将突变后pWSK29载体以&sHlI单酶切，并将酶 切产物去磷酸化，然后用T4连接酶(Promega,美国)将上述扩增片 段和突变后的pWSK29载体的酶切产物在22"C循环水浴中连接3h，转 化大肠杆菌DH5a细胞，用Wizard Plus SV Midipreps DNA Purification System (Promega，美国)提取质粒，以&5HII单酶切鉴定。改造后 的载体去掉了原有的多克隆位点，只含有构建感染性克隆所需要的 C/a I 、 ￡coR I和5^/z I位点，将该改造后的载体命名为pWSK29m/A。突变及载体改造所用引物的具体序列如表l所示。表l载体突变及改造所用引物引物名称引物用途pNSP2-FPRRSV无义序列pNSP2-R扩增Spe-Upper3536A—TSpe-LowerBssH-Upper5124G—CBssH-Lower引物序列(5'-3')TTG GCGCGC C A ACC 4 7 GGCTCTGGTGCGACTACTATCAACTCAAAGGAAAAGGIC7^GrAATTATCATTGAC GTCAATGATAATTACTAGACCTTTTCCTTTGAGTTG GTGGTGTTCGGGCGGT￡CGCGCAAGATCCATTATG CATAATGGATCTTGCGCGGACCGCCCGAACACCAC注XXXX为限制性内切酶识别序列;XXXX为突变位点实施例2脑心肌炎病毒总RNA的提取取猪脑心肌炎病毒BJC3的F8代细胞培养病毒，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit ( Qiagen,德国)，按照试剂盒说明书中的具体步 骤提取BJC3病毒的总RNA。获得的RNA以20(iL RNase-free water (AmbionInc.,美国)溶解，于-70。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建脑心肌炎病毒的感染性克隆的方法，其包括步骤：　（１）改造低拷贝质粒载体，使其只含有构建感染性克隆所需的酶切位点；　（２）提取脑心肌炎病毒的总ＲＮＡ；　（３）用ＲＴ－ＰＣＲ方法分三个片段扩增脑心肌炎病毒的全长ｃＤＮＡ，获得的三个片段的ｃＤＮＡ两端分别含有不同的酶切位点；　（４）将三个片段的ｃＤＮＡ分别建立亚克隆；　（５）用双酶切的方法将三个片段的ｃＤＮＡ依次定向克隆至改造的低拷贝质粒载体中，得到含有脑心肌炎病毒全长ｃＤＮＡ的脑心肌炎病毒感染性克隆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨汉春，盖新娜，郭鑫，张国庆，朱书，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]