一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂制造技术

本发明专利技术之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，试剂R2是由甘氨酸1.4—7.0g、聚乙二醇6000 10‑30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100‑600mg、牛血清白蛋白（BSA）10‑30 g、Proclin300 1‑5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，本发明专利技术组方科学合理，易生产制备，使用方便、安全、准确，可有效用于快速检测食品中的莱克多巴胺，确保食品安全，经济和社会效益显著。

A reagent for quantitative detection of ractopamine by latex enhanced turbidimetric immunoassay

The purpose of the invention is to provide a latex enhanced immune turbidity reagent method for quantitative detection of ractopamine, including reagent R1, R2 reagent, R1 reagent is composed of glycine 3.75 15.01g, ractopamine carrier antigen complex 0.2 1.1g distilled water volume to 1000ml made, agent R2 is composed of 1.4 glycine 7.0g, 30 10 polyethylene glycol 6000 G, carboxyl latex and anti ractopamine monoclonal antibody 100 crosslinked latex 600mg, bovine serum albumin (BSA) 10, Proclin300 g 30 1 5 ml, adding distilled water volume to 1000ml is made, the formula of the invention is scientific and reasonable, easy production preparation, convenient, safe and accurate, can be effectively used for rapid detection of ractopamine in food, to ensure food safety, significant economic and social benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂
本专利技术涉及一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，属于食品安全检测

技术介绍
莱克多巴胺（ractopamine，RAC）是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂(俗称β-兴奋剂)类化合物，分子量：337.83；是由美国制药公司最先研究出的毒性小、代谢快的克伦特罗替代品，属于第二代瘦肉精。因其具有调节蛋白质合成的作用，国外也称为蛋白质再分配剂(Repartitioner)，在临床上主要用于治疗支气管哮喘、充血性心力衰竭症和肌肉萎缩症等。莱克多巴胺的毒性远低于具有相同功能的其它瘦肉精添加物。常规剂量的瘦肉精类药物可在机体内被代谢并排出体外，不会对机体造成伤害，但过量摄入莱克多巴胺，人体会出现不同程度的中毒反应，其症状与动物中毒症状相似，表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心眩晕等症状，重者可引发高血压、心脏病甚至死亡。当莱克多巴胺的使用量为临床使用量的5～10倍时，可以增加胴体蛋白质含量、减少脂肪组织，有效提高瘦肉率和饲料利用率。目前世界各国对莱克多巴胺在养殖业的适用范围的规定不尽相同。国际食品法典委员会(CAC)制定的莱克多巴胺在猪和牛中的最高残留量(MRL)标准均为:肌肉10μg/kg、脂肪10μg/kg、肝40μg/kg、肾90μg/kg，每日允许摄入量(ADI)为0-1μg/kg。世界各国对莱克多巴胺在养殖业适用范围的规定不尽相同。在美国、加拿大、日本、墨西哥、巴西、澳大利亚等24个国家和地区，莱克多巴胺可作为瘦肉精被允许用于畜禽养殖，以提高动物的蛋白质含量和瘦肉率；但在欧盟、中国、俄罗斯等国家，畜牧养殖中该类药物被全面禁止。中国台湾地区不允许使用，但允许进口使用了β-兴奋剂的动物产品。2002年，农业部、原卫生部、原国家药品监督管理局联合发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)禁止莱克多巴胺在动物养殖中的使用。2011年12月5日，工信部、农业部、商务部、原卫生部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局六部委发布联合公告(2011年第41号)，要求即日起在我国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。目前我国检测饲料、猪肌肉及其脏器、猪尿中莱克多巴胺的常规方法是酶联免疫（ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱－质谱（GC-MS）法和胶体金免疫层析（CIA）法。酶联免疫（ELISA）法定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有莱克多巴胺蛋白偶联物，加入待测莱克多巴胺标准品或样品溶液及特异性的抗莱克多巴胺的抗体，包被在微孔板上的莱克多巴胺蛋白偶联物和标准品或样品中的莱克多胺竞争性地与抗体结合；再加入酶标二抗，形成抗原抗体复合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的莱克多巴胺浓度与吸收光强度成反比。该方法操作步骤多，反应时间长，检测费用昂贵，不适于分析大批量的样品。高效液相色谱（HPLC）法定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：用2％氨/甲醇溶液提取试样中的莱克多巴胺，经固相萃取柱净化，浓缩后用2％乙酸溶液定容，用高效液相色谱－荧光检测法分离测定。其中需要使用高效液相色谱仪（配荧光检测器）、冷冻离心机、振荡器、涡旋混合器、分析天平、旋转蒸发仪、氮吹仪一系列仪器设备。莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算样品含量。该方法操作步骤繁琐，反应时间长，需要大量精密仪器，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。气相色谱－质谱（GC-MS）定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：试样中莱克多巴胺先用2％氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脱脂，然后用柱净化，BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GC－MS法进行定性定量分析。将莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入气相色谱－质谱联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。该方法操作步骤繁琐，反应时间长，需要使用精密仪器，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。胶体金免疫层析方法（CIA）检测莱克多巴胺的主要工作原理：采用胶体金免疫层析技术和竞争抑制原理，将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。检测时，样品中的莱克多巴胺在流动过程中与胶体金标记的特异性莱克多巴胺抗体结合，抑制了莱克多巴胺抗体与固相载体膜上的莱克多巴胺-BSA偶联物的结合，如果样品中含有莱克多巴胺时，则检测线T在规定时间内不显颜色，结果为阳性，反之，若检测线T显红色色带，结果为阴性。无论样品中莱克多巴胺浓度高低，C线均显红色色带。该方法操作方便，检测时间短，缺点：该技术只能对样品进行定性检测，不能实现对样品定量检测和动态监测。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，可有效解决快速检测食品中是否含有莱克多巴胺，确保食品安全的问题。本专利技术解决的技术方案是，本专利技术试剂包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4-二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01MPH=7.2PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；所述的试剂R2是由甘氨酸3.75—15.01g、聚乙二醇600010-30g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30g、Proclin3001-5ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒大小50-500nm，溶于PH6.5，50mM10mlMES中，称取交联剂EDC20mg、S-NHS20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MESPH6.5,50mM10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml0.01MPH7.2PBS液中，即为活化胶乳；(2)活化后胶乳每毫升中加入400ug抗莱克多巴胺单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时；随后每毫升加入10%BSA溶液500ul，继续室温搅拌反应2小时；离心20000rpm，40分钟，去本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4‑二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01M PH=7.2 PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；所述的试剂R2是由甘氨酸3.75—15.01g、聚乙二醇6000 10‑30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100‑600mg、牛血清白蛋白（BSA）10‑30 g、Proclin300 1‑5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20‑200mg，胶乳颗粒大小50‑500nm，溶于PH6.5，50mM 10ml MES中，称取交联剂EDC 20mg、S‑NHS 20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MES PH6.5,50mM 10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml 0.01M PH7.2 PBS液中，即为活化胶乳；(2)活化后胶乳每毫升中加入400ug抗莱克多巴胺单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时；随后每毫升加入10%BSA溶液500ul，继续室温搅拌反应2小时 ；离心20000rpm，40分钟，去上清，沉淀使用甘氨酸溶液复溶即制成羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳。...

【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4-二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01MPH=7.2PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；所述的试剂R2是由甘氨酸3.75—15.01g、聚乙二醇600010-30g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30g、Proclin3001-5ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒大小50-500nm，溶于PH6.5，50mM10mlMES中，称取交联剂EDC20mg、S-NHS20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MESPH6.5,50mM10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml0.01...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昊旻，郑蓬举，王威风，张倩茹，
申请(专利权)人：河南联博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41