一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体的制备方法及应用，属于抗体制备技术领域。本发明专利技术所述抗体是由HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物，其可与石斑鱼血清免疫球蛋白特异性结合，并可使HRP的底物显色。本发明专利技术制备的HRP标记抗体纯度高、酶活性高、结合物标记率适宜，进行ELISA试验的稀释度大，而且灵敏度高；可用于检测石斑鱼的病毒性疾病、寄生虫性疾病和细菌性疾病。

Preparation and application of Rabbit anti fish serum immunoglobulin HRP labeled antibody

The invention discloses a Rabbit anti fish serum immunoglobulin HRP antibody preparation method and application, belonging to the technical field of antibody preparation. The antibody of the present invention is an enzyme antibody conjugate composed of HRP and Rabbit anti grouper serum immunoglobulin antibody, which can specifically combine with immunoglobulin of grouper serum, and can make HRP substrate color. The HRP labeled antibody prepared by the invention has high purity, high enzyme activity and suitable labeling rate of the conjugates, and the ELISA test has high dilution and high sensitivity, and can be used for detecting the viral diseases, parasitic diseases and bacterial diseases of the grouper.

【技术实现步骤摘要】
一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体的制备方法及应用
本专利技术属于抗体制备
，具体涉及一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体的制备方法及应用。
技术介绍
石斑鱼是目前海水养殖鱼类中的高档优质鱼类。随着我国石斑鱼人工育苗技术的成熟和斜带石斑鱼苗种产业化大规模生产，成为重要的海水鱼类养殖品种。但是近几年病害频发，给石斑鱼的养殖产业造成巨大的经济损失。病毒、寄生虫和细菌感染对仔鱼和幼鱼危害极大，给海水鱼类养殖业造成巨大的损失。目前，通常采用PCR法检测石斑鱼病毒、寄生虫和细菌感染，PCR法是通过检测鱼体脑和眼睛中病毒基因的表达，来鉴定病害的侵染；然而，在石斑鱼的育苗中，亲鱼作为育苗的主体，不可能将亲鱼杀死再通过PCR法检测；因此，亟需一种保证鱼体正常生命力的基础上，检测病害的方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的技术方案是：一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体，它是由HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物，其可与石斑鱼血清免疫球蛋白特异性结合，并可使HRP的底物显色。在上述方案的基础上，所述石斑鱼为斜带石斑鱼。在上述方案的基础上，所述HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物是用过碘酸钠对HRP进行氧化后，加入纯化的鱼免疫球蛋白的抗体进行偶联，偶联完成后加入保护剂并用硼氢化钠进行还原。在上述方案的基础上，所述HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物的制备方法，步骤如下：a.取6mgHRP溶于1mL蒸馏水中，0.05M过碘酸钠溶液1mL，混匀后，4℃冰箱静置避光25min；b.取出后加入0.2mol/L乙二醇水溶液0.8mL，于室温放置25min后，加入含15mg兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的水溶液5mL，混匀后透析过夜；c.吸出加7mg/mLNaBH4溶液0.5mL，混匀置4℃冰箱2h；d.加等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h后，3000r/min低温离心30min，弃上清；e.将沉淀用0.02mol/LpH7.4的PBS溶解后，装入透析袋中，放入0.02mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，4℃透析；f.透析后，于10000r/min离心30min，收集上清液即得抗体的酶结合物，加入等量甘油，混匀，分装，保存于-20℃。在上述方案的基础上，所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的制备方法，步骤如下：1)石斑鱼血清免疫球蛋白纯化a.杀鱼取血，静置取血清，向血清中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为10％，10000r/min离心5min，弃沉淀；b.向上述离心后的溶液中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为30％，10000r/min离心5min，弃上清；c.将上述沉淀用PBS缓冲液溶解，Bradford法测定蛋白浓度；2)石斑鱼免疫球蛋白兔抗体的制备与纯化a.将2mg纯化的鱼免疫球蛋白加入佐剂系统混匀，用于免疫兔，每两次免疫之间间隔2周；第4次免疫后，耳静脉取血，用ELISA定性测定，测定效价达到40000以上，杀兔取全血；b.将免疫后的兔血静置后取血清，血清于20000g离心30min，取上清加入proteinA填料中进行亲和吸附，并用PBS缓冲液漂洗两次，之后用pH为2.5的甘氨酸洗脱，立即用1.5MpH为8.0的Tris缓冲液中和洗脱液的pH至7.4；最后在4℃下用PBS缓冲液透析中和后的洗脱液，透析后的溶液即为鱼血清免疫球蛋白的抗体溶液。一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体的应用，用于检测石斑鱼的病毒性疾病、寄生虫性疾病和细菌性疾病。在上述方案的基础上，所述病毒性疾病为神经坏死病毒感染；所述寄生虫性疾病为刺激隐核虫感染；所述细菌性疾病为副溶血弧菌感染。一种检测石斑鱼神经坏死病毒的试剂盒，包含上述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体。在上述方案的基础上，所述检测石斑鱼神经坏死病毒的试剂盒，还包括抗原；所述抗原为引起石斑鱼病毒性疾病、寄生虫性疾病和细菌性疾病的病原微生物蛋白。在上述方案的基础上，检测方法如下：a.将抗原用PBS缓冲液稀释至5μg/mL后，加入elisa板中，37℃孵育2h，或4℃包被过夜；自来水洗板三次；b.倒掉elisa板中的抗原溶液，加入封闭液封闭，湿盒中37℃孵育1h；c.倒掉封闭液加入待测鱼血清，湿盒中37℃孵育1h，自来水洗板6次；d.加入1∶2000稀释的兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体，湿盒中37℃孵育1h；e.倒掉兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体溶液，自来水洗板6次后，加入显色液显色，室温避光静置15min；f.加入2M的H2SO4终止显色，在酶标仪中读取492nm波长下的OD值。所述斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)为石斑鱼属，来源于厦门小嶝水产科技有限公司水产养殖场。本专利技术的有益效果：本专利技术制备的HRP标记抗体纯度高、酶活性高、结合物标记率适宜，进行ELISA试验的稀释度大，而且灵敏度高。本专利技术制备的标记抗体可用于石斑鱼类诸多病害的监控与检测，其优点主要有1.具有单克隆抗体不具有的优点，可以检测石斑鱼多种病原的感染，如寄生虫感染、细菌感染及病毒病的感染，而单克隆抗体只能针对一种病原进行检测；2.不仅能够对病原的感染进行定性(是否感染)，而且还可以大致确定病原感染的程度，如感染6天和15天后其检测效价不同，效价越高，说明病原感染越严重。3.可以针对某种病原的感染做标准曲线，然后检测，可以对相关疾病的发生发展进行实时监控。附图说明图1神经坏死病毒感染的标准曲线；图2刺激隐核虫感染的标准曲线；图3副溶血弧菌感染的标准曲线。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11.兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的制备1)石斑鱼血清免疫球蛋白纯化a.杀鱼取血，静置取血清，向血清中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为10％，10000r/min离心5min，弃沉淀；b.向上述离心后的溶液中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为30％，10000r/min离心5min，弃上清；c.将上述沉淀用PBS缓冲液溶解，Bradford法测定蛋白浓度；2)石斑鱼免疫球蛋白兔抗体的制备与纯化a.将2mg纯化的鱼免疫球蛋白加入佐剂系统混匀，用于免疫兔，每两次免疫之间间隔2周；第4次免疫后，耳静脉取血，用ELISA定性测定，测定效价达到40000以上，杀兔取全血；b.将免疫后的兔血静置后取血清，血清于20000g离心30min，取上清加入proteinA填料中进行亲和吸附，并用PBS缓冲液漂洗两次，之后用pH为2.5的甘氨酸洗脱，立即用1.5MpH为8.0的Tris缓冲液中和洗脱液的pH至7.4；最后在4℃下用PBS缓冲液透析中和后的洗脱液，透析后的溶液即为鱼血清免疫球蛋白的抗体溶液。所述斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)为石斑鱼属，来源于厦门小嶝水产科技有限公司水产养殖场。2.兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的HRP标记a.取6mgHRP溶于1mL蒸馏水中，0.05M过碘酸钠溶液1mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体，其特征在于：它是由HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物，其可与石斑鱼血清免疫球蛋白特异性结合，并可使HRP的底物显色。

【技术特征摘要】
1.一种兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体，其特征在于：它是由HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物，其可与石斑鱼血清免疫球蛋白特异性结合，并可使HRP的底物显色。2.根据权利要求1所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记抗体，其特征在于：所述石斑鱼为斜带石斑鱼。3.根据权利要求1或2所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记的抗体，其特征在于：所述HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物是用过碘酸钠对HRP进行氧化后，加入纯化的兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体进行偶联，偶联完成后加入保护剂并用硼氢化钠进行还原。4.根据权利要求3所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记的抗体，其特征在于：所述HRP与兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体组成的酶抗体结合物的制备方法，如下：a.取6mgHRP溶于1mL蒸馏水中，加入0.05M过碘酸钠溶液1mL，混匀后，4℃冰箱静置避光25min；b.取出后加入0.2mol/L乙二醇水溶液0.8mL，于室温放置25min后，加入含15mg兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的水溶液5mL，混匀后透析过夜；c.向透析后的溶液中加入7mg/mLNaBH4溶液0.5mL，混匀置4℃冰箱2h；d.取出后加等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h后，3000r/min低温离心30min，弃上清；e.将沉淀用0.02mol/LpH7.4的PBS溶解后，装入透析袋中，放入0.02mol/LpH7.4的PBS中，4℃透析；f.透析后，于10000r/min离心30min，收集上清液即得抗体的酶结合物，加入等量甘油，混匀，分装，保存于-20℃。5.根据权利要求3或4所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白HRP标记的抗体，其特征在于：所述兔抗石斑鱼血清免疫球蛋白抗体的制备方法，步骤如下：1)石斑鱼血清免疫球蛋白纯化a.杀鱼取血，静置取血清，向血清中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为10％，10000r/min离心5min，弃沉淀；b.向上述离心后的溶液中加入硫酸铵溶液，使其终浓度为30％，10000r/min离心5min，弃上清；c.将上述沉淀用PBS缓冲液溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛辉，林克冰，黄种持，朱志煌，
申请(专利权)人：福建省水产研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35