一种检测双氢青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗体技术

本发明专利技术公开了一种检测双氢青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗体。本发明专利技术所提供的双氢青蒿素的检测方法，包括利用抗血清或抗体实现双氢青蒿素的检测；抗血清和抗体分别为利用式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到的抗血清和抗体；载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白；双氢青蒿素的检测方法采用酶联免疫吸附方法进行。实验证明，本发明专利技术的式(Ⅱ)所示化合物可以作为半抗原，与载体蛋白偶联后得到的抗原免疫动物，可以得到特异性针对双氢青蒿素抗原的抗体，且灵敏度高，双氢青蒿素检测IC50值可达1.16ng/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种检测双氢青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗体
本专利技术涉及生物
中，一种检测双氢青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗体。
技术介绍
青蒿素衍生物如青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素等对治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾具有高效、低毒、速效、复燃率低等显著疗效。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是东南亚、非洲应用较大的抗疟疾药物。假冒、劣质以及不符合标准的青蒿素药物对疟疾病情的防控造成了重大威胁，而这种伪劣假冒现象在东南亚、非洲等落后地区尤为突出。因此急需建立一种快捷、可靠的针对青蒿素及其衍生物的定性定量分析方法。双氢青蒿素的化学名为(3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-八氢-3,6,9-三甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二氧七环-10(3H)-醇，CAS登记号为81496-81-3；71939-50-9；123930-80-3，分子式为C15H24O5，相对分子量为284.34806，化学结构式见式(Ⅰ)。目前国内外已发表的文献中，双氢青蒿素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。这些方法都需要昂贵的仪器设备，检测费用高，操作时间长，操作技术要求高且不能用于现场检测。另外，前人也曾制作出双氢青蒿素相应抗体，但起灵敏度一般在100-500ng/mL同时对青蒿素其他衍生物如青蒿琥酯有较高的较差反应率，不能做到特异性检测双氢青蒿素。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测双氢青蒿素的方法及所用半抗原、抗原、抗血清和抗体。本专利技术首先提供了双氢青蒿素的检测方法，所述方法包括利用抗血清或抗体实现双氢青蒿素的检测；所述抗血清和所述抗体分别为利用式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到的抗血清和抗体；上述方法中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。上述方法中，式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白通过酰胺键连接。所述酰胺键是式(Ⅱ)所示化合物的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。所述偶联物的结构式见式(Ⅲ)。所述偶联物的制备方法包括：在NHS和EDC的作用下促使式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白偶联。制备所述偶联物时，式(Ⅱ)所示化合物、NHS和EDC的摩尔比可为1：(1-5)：(1-5)。制备所述偶联物时，所述反应的条件可为：0-50℃反应4-36小时。制备所述偶联物时，式(Ⅱ)所示化合物与所述载体蛋白的摩尔比可为(5-30)：1；具体可为(15-17)：1，更具体可为15：1。所述偶联物的制备方法具体如下：将0.036mmol式(Ⅱ)所示化合物、0.047mmolNHS和0.040mmolEDC，用有机溶剂(如DMSO)溶解，25℃搅拌反应6小时，然后滴加入含0.0024mmol载体蛋白的载体蛋白溶液(载体蛋白溶液具体是将0.0024mmolOVA溶于5mLpH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的)，4℃搅拌12小时。所述偶联物的制备方法包括如下步骤：在NHS和EDC的作用下促使式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白偶联。制备所述偶联物时，式(Ⅱ)所示化合物、NHS和EDC的摩尔比可为1：(1-5)：(1-5)。制备所述偶联物时，所述反应的条件可为：0-50℃反应4-36小时。制备所述偶联物时，式(Ⅱ)所示化合物与所述载体蛋白的摩尔比可为(5-30)：1；具体可为(15-17)：1，更具体可为15：1。所述偶联物的制备方法具体如下：将0.04mmol式(Ⅱ)所示化合物、0.052mmolNHS和0.044mmolEDC，用有机溶剂(如DMSO)溶解，25℃搅拌反应6小时，离心(离心参数具体可为：8000rpm离心5分钟)收集上清液，然后滴加入含0.0024mmol载体蛋白的载体蛋白溶液(载体蛋白溶液具体是将0.0024mmolOVA溶于5mLpH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的)，4℃搅拌12小时。上述方法中，所述抗血清和所述抗体分别可为利用所述偶联物免疫动物得到的抗血清和抗体。所述动物具体可为哺乳动物，如小鼠。上述方法中，所述双氢青蒿素的检测方法可采用酶联免疫吸附方法(ELISA)进行。本专利技术还提供了下述P1)-P4)中任一所述产品：P1)式(Ⅱ)所示化合物；P2)所述偶联物；P3)所述抗血清；P4)所述抗体。本专利技术还提供了(Ⅱ)所示化合物的制备方法，所述方法包括：将式(Ⅶ)所示化合物和硼氢化钾反应，获得(Ⅱ)所示化合物；制备式(Ⅱ)所示化合物时，所述反应的条件可为：0-6℃反应。式(Ⅱ)所示化合物的制备方法具体如下：在三口烧瓶中加入4.15mmol式(Ⅶ)所示化合物和12.9mL无水甲醇，于室温下边搅拌边加入1.41mmol无水氯化钙作为催化剂，于0℃-5℃温度条件下分三批次加入5.02mmol硼氢化钾，反应进行情况由TLC薄层层析进行实时监测，反应结束后使用32％(w/w)盐酸水溶液终止，蒸馏水洗涤减压脱溶后得白色粉末，即为产物。即为式(Ⅱ)所示化合物。本专利技术还提供了所述偶联物在制备抗血清或抗体中的应用。本专利技术还提供了式(Ⅱ)所示化合物在作为半抗原中的应用；本专利技术还提供了所述偶联物在作为免疫原中的应用。本专利技术还提供了下述任一应用：X1、所述产品在检测双氢青蒿素中的应用；X2、所述产品在制备用于检测双氢青蒿素的试剂盒中的应用；X3、所述产品在制备用于检测双氢青蒿素的免疫亲和色谱柱中的应用。上述应用中，所述试剂盒可为酶联免疫吸附试剂盒。待检样本可为水体、药品、食品或土壤。本专利技术提供了一种化合物，即式(Ⅱ)所示化合物，该化合物可以作为半抗原，该半抗原与载体蛋白偶联后可以得到抗原，用抗原免疫动物，可以得到特异性针对双氢青蒿素抗原的抗体，且灵敏度高，双氢青蒿素检测IC50值可达1.16ng/mL。本专利技术还提供了所述化合物的制备方法，步骤简洁、成本低廉。用本专利技术方法制备的抗体的特异性好(与双氢青蒿素结构类似物的交叉反应率低)、灵敏度高。本专利技术可用于双氢青蒿素药物的大规模检测与质量控制，在双氢青蒿素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。附图说明图1为制备式(Ⅱ)所示化合物的流程示意图。图2为制备偶联物的流程示意图。图3为双氢青蒿素直接ELISA法标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。硼氢化钾、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA，分子量68kDa)和卵清白蛋白(OVA，分子量为44kDa)均为Sigma公司产品。羊抗小鼠IgG-HRP为Jackson公司产品。邻苯二胺(OPD)、氨基乙酸、氨基丙酸等其余常规试剂均为北京化学试剂公司产品。双氢青蒿素：阿拉丁试剂(上海)有限公司，货号为71963-77-4。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的化学结构式见式(Ⅴ)。N-羟基本文档来自技高网...

【技术保护点】
双氢青蒿素的检测方法，包括利用抗血清或抗体实现双氢青蒿素的检测；所述抗血清和所述抗体分别为利用式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到的抗血清和抗体；

【技术特征摘要】
1.双氢青蒿素的检测方法，包括利用抗血清或抗体实现双氢青蒿素的检测；所述抗血清和所述抗体分别为利用式(Ⅱ)所示化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到的抗血清和抗体；2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述双氢青蒿素的检测方法采用酶联免疫吸附方法进行。4.下述P1)-P4)中任一所述产品：P1)权利要求1中式(Ⅱ)所示化合物；P2)权利要求1或2中所述偶联物；P3)权利要求1或2中所述抗血清；P4)权利要求1或2中所述抗体。5.权利要求1中(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，宁香雪，王冕，谭桂玉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11