本发明专利技术公开了一种四环素的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：吖啶酯标记的四环素抗原或抗体、磁微粒偶联的抗体或抗原、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系。与现有技术相比，本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点。
A chemiluminescence detection kit for tetracycline and its preparation method
The invention discloses a chemiluminescence detection kit for tetracycline and a preparation method thereof. The kit includes: tetracycline antigen or antibody, magnetic particle coupling acridinium ester labeled antibody or antigen, tetracycline series standard solution, chemiluminescence prespark liquid A, chemiluminescence excitation B liquid, cleaning liquid. The reagent kit combines chemiluminescence technology with immune magnetic particles to provide a reaction system close to the homogeneous phase. Compared with the prior art, the kit has the advantages of high sensitivity, strong specificity, short reaction time, etc..
【技术实现步骤摘要】
一种四环素的化学发光检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于食品安全检测领域，具体是一种四环素的免疫化学发光检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
四环素是四并苯或萘并苯的衍生物，是一种光谱抗菌药。它是由链霉菌培养液中提取或经半合成而得的抗生素，因其分子中含有4个环而得名。在水产、牛奶、鸡蛋、蜂王浆等中加入四环素，可用于抑制多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所引起的感染。但是四环素类药物主要通过肾小球滤出，这类药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。如与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐、与铁离子形成红色络合物。在体内四环素会与钙离子形成黄色络合物而沉积在骨骼和牙齿上，小儿服用会发生牙齿变黄，孕妇服用后其产儿可能发生牙齿变色，进而影响牙齿和骨骼的发育。此外，这类药物还会引起肝损害，会使肠道菌群失调、易诱导耐药菌株。因而食品中四环素残留会对人们的身体健康带来极大的隐患。国家质量监督检验检疫局在2008年对牛奶和奶粉中四环素的残留量做出规定，2009年对蜂蜜中四环素的残留量做出规定，因此我们对食品中残留的四环素的检测具有非常重要的意义。目前四环素的检测方法有:微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法、胶体金法、化学发光法。微生物法特异性差，操作繁琐，检测周期较长且结果误差较大。CN1707265A（2005年12月）公开了一种酶联免疫法检测四环素的试剂盒,采用酶联免疫法进行检测的缺点是辣根过氧化酶或碱性磷酸标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确，并且只适用于微量物质的检测和鉴定。CN102401818A（2012年4月）公开了一种高效液相色谱法检测四环素的方法,采用高效液相色谱法的缺点为样品前处理复杂，费力费时，检测成本高。CN103105490A（2011年11月）公开了一种胶体金检测四环素的试剂盒,采用胶体金法进行检测的缺点是最后检测结果是以肉眼可见的颜色进行表征，误差较大，并且操作繁琐，流程较多，更易出现误差，灵敏度低。本专利技术采用方法为直接化学发光法，采用吖啶酯作为化学发光标记物的优点是：①背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。本专利技术采用的方法为化学发光法，其优点为：灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、线性范围宽，检测结果具有更高的准确性与重复性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有较高灵敏度和特异性的检测食品中四环素的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种四环素的化学发光检测试剂盒及制备方法，本专利技术所提供的化学发光法检测四环素的试剂盒，可以采取四环素抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素，也可以采取四环素抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素抗体。试剂盒还包括四环素校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。作为本专利技术进一步的方案，所述化学发光标记物为吖啶酯，如：NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是四环素抗原或四环素抗体。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯标记四环素抗原或抗体的标记缓冲液为pH8.0-11.0、浓度为0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3，优选pH为10.0。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯与抗原或抗体的摩尔比为5-100:1，优选摩尔比为7.4:1。作为本专利技术进一步的方案，所述的吖啶酯溶于DMSO或DMF中，且所配制溶液的最终浓度为0.1-100mmol/L，优选浓度为6.5mmol/L。作为本专利技术进一步的方案，所述的磁微粒可直接与四环素抗体或抗原偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记四环素抗体或抗原。作为本专利技术进一步的方案，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，长时间放置磁珠抱团个数少，沉降速度慢的磁珠。作为本专利技术进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0%BSA和0.1-0.5%PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成，校准品形态为液态。作为本专利技术进一步的方案，所述的四环素校准品溶液浓度分别为：0μg/L、0.02μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L、12.5μg/L、62.5μg/L。作为本专利技术进一步的方案，本专利技术所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.05-5%，HNO3浓度为0.05-2.5mol/L。作为本专利技术进一步的方案，本专利技术所述的化学发光激发液B为TritonX-100和NaOH的混合液，其中TritonX-100的浓度为0.05-2.0mol/L，NaOH的浓度为0.05-1.0mol/L。作为本专利技术进一步的方案，所述的清洗液包括以下组分：pH值7.0-9.0、浓度为5.0-50.0mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含有浓度为0.05-0.50mmol/L的NaCl及质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。本专利技术的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子检测产物浓度。本专利技术的优点在于采用竞争法联合磁微粒化学发光技术以测定食品中的四环素的含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。具体实施方式本专利技术提供了一种四环素的化学发光检测试剂盒，为使本专利技术目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供一种四环素的化学发光检测试剂盒及制备方法，其中，本专利技术所提供的化学发光方法检测四环素的试剂盒，可以采取四环素抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素，也可以采取四环素抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素抗体。试剂盒还包括四环素校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。具体地，本专利技术在制备磁微粒偶联的过程中，所述偶联抗原的缓冲液为pH值5.0、浓度为0.1mol/LMES的缓冲液；所述偶联抗体的缓冲液为pH值6.0、浓度为0.1mol/LMES的缓冲液。具体地，本专利技术在制备磁微粒偶联抗原或抗体的过程中，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。具体地，本专利技术所述校准品是用含有1%BSA和0.1%PC300的Tris-HCl的缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成，校准品形态为液态。具体地，本专利技术所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1mol/L。具体地，本专利技术所述化学发光激发液B为TritonX-100和NaOH的混合液，其中TritonX-100的浓度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种四环素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：吖啶酯标记的四环素抗原、偶联有四环素抗体的磁微粒、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
【技术特征摘要】
1.一种四环素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：吖啶酯标记的四环素抗原、偶联有四环素抗体的磁微粒、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。2.根据权利要求1所述的四环素化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。3.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是四环素抗原。4.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒可直接与四环素抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记四环素抗体。5.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的校准品是以含有0.5-5.0%BSA和0.1-0.5%PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成的系列浓度梯度...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹晶，刘丽青，胡雪婷，常燕，杜爱铭，徐兵，
申请(专利权)人：太原瑞盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14
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