一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体‑酶标奈替米星复合物的指示试剂；上述酶标奈替米星由奈替米星和葡萄糖脱氢酶偶联而成。本发明专利技术的奈替米星免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中奈替米星含量。与市场上现有的检测试剂相比，本发明专利技术检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体是一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法。
技术介绍
奈替米星（Amikacin）是一种新一代半合成的广谱氨基糖苷类抗生素。对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌都具有良好的抑菌和杀菌作用，临床主要用于对卡那霉素或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌所致的尿路、下呼吸道、腹腔、软组织、骨和关节、生殖系统等部位的感染，以及败血症等。相较于其他氨基糖苷类抗生素，奈替米星分子中存在较少被酶攻击的位点，所以不良反应较同类药物小。但是，浓度过高也会产生耳鸣、听力减退和甚至死亡等不良反应，故对奈替米星的体内血药浓度检测是非常必要的。目前检测奈替米星的常用方法有：高效液相色谱分析（HPLC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、和荧光偏振法（FPIA）等。其中，HPLC费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；FPIA法试剂依赖进口，价格昂贵且有效期较短，临床上无法大规模使用。本专利技术采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中奈替米星检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本专利技术提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中奈替米星含量的奈替米星均相酶免疫检测试剂及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体-酶标奈替米星复合物的指示试剂；上述酶标奈替米星由奈替米星和葡萄糖脱氢酶偶联而成。作为本专利技术进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。作为本专利技术进一步的方案，所述的一种奈替米星免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物的制备：制备葡萄糖脱氢酶（GDH）溶液，奈替米星的活化，将GDH与奈替米星偶联，纯化偶联的酶标抗原；（2）奈替米星均相酶免疫检测试剂的制备：试剂1的制备：由奈替米星抗体和均相酶底物混合而成；试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。作为本专利技术进一步的方案，所述的一种奈替米星免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：1）葡萄糖脱氢酶（GDH）溶液的制备：a.称取5-30mg规格为100-300KU的GDH，室温溶解于5-10mLPBS缓冲液中；2）奈替米星的活化将如下化学品加入到烧杯中搅拌溶解：10-40mg奈替米星、10-50mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、2-20mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，溶解于吗啉乙磺酸（MES）溶液中，于室温下搅拌溶解，反应15-60分钟；3）GDH与奈替米星的偶联a.将上述活化的奈替米星溶液逐滴加入到上述溶解的GDH溶液中；b2-8℃搅拌过夜；4）纯化偶联的酶标抗原通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物，于2-8℃下储存。作为本专利技术进一步的方案，所述的一种奈替米星免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：试剂1的制备：将2-5g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3g葡萄糖用0.5-2L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将奈替米星抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。作为本专利技术进一步的方案，所述的奈替米星免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将待测样本与奈替米星抗体接触；2）根据待测样本中酶标奈替米星与奈替米星抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中奈替米星的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。本专利技术的原理是抗原与酶结合成酶标抗原，保留抗原和酶的生物活性，当酶标抗原与抗体结合后，抗原分子上的酶蛋白与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响，酶的活性受到抑制。测定时样本中的抗原、酶标抗原与抗体竞争性结合，样本中的抗原含量越高，加底物后其OD值越高。本专利技术的优点在于：本专利技术的奈替米星免疫检测试剂可以精确快速地确定人体血液等样品中奈替米星含量。与市场上现有的检测试剂相比，本专利技术检测试剂具有方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确等优点，有利于临床的推广使用。附图说明图1是奈替米星均相酶免疫反应校准曲线图。图2是奈替米星均相酶免疫线性范围图。具体实施方式本专利技术提供了一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法，为使本专利技术目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供了一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法。包括：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体-酶标奈替米星复合物的指示试剂；上述酶标奈替米星由奈替米星和葡萄糖脱氢酶偶联而成。本专利技术中所指的“奈替米星”不仅仅指完整的奈替米星分子，也包括保留完整抗原特异性结合能力的奈替米星片断或者衍生物。一种奈替米星均相酶免疫检测试剂，包括：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体-酶标奈替米星复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物，其可通过化学合成方法得到。上述的奈替米星免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：1）将待测样本与奈替米星抗体接触；2）根据待测样本中酶标奈替米星与奈替米星抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中奈替米星的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液等。优选的，待测样本为血清或血浆。下面通过具体的实施例对本专利技术进行详细说明。实施例一：葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物的制备1）葡萄糖脱氢酶（GDH）溶液的制备：a.称取25mg规格为150KU的GDH，室温溶解于8mL浓度为10mM的PBS溶液中，pH=7.4；2）奈替米星的活化将如下化学品加入到烧杯中搅拌溶解：20mg奈替米星、30mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、15mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，溶解于800μL吗啉乙磺酸（MES）溶液中，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；3）GDH与奈替米星的偶联a.将上述活化的奈替米星溶液逐滴加入到上述溶解的GDH溶液中；b2-8℃搅拌过夜；4）纯化偶联的酶标抗原通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物，于2-8℃下储存。实施例二：奈替米星均相酶免疫检测试剂的制备奈替米星均相酶免疫检测试剂，包括：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体-酶标奈替米星复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物，其可通过化学合成方法得到。奈替米星均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体‑酶标奈替米星复合物的指示试剂。

【技术特征摘要】
1.一种奈替米星免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标奈替米星、用于检测奈替米星抗体-酶标奈替米星复合物的指示试剂。2.根据权利要求1所述的奈替米星的免疫检测试剂，其特征在于：所述酶标奈替米星由奈替米星和葡萄糖脱氢酶偶联而成。3.根据权利要求1所述的奈替米星免疫检测试剂，其特征在于：所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。4.一种奈替米星免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物的制备：制备葡萄糖脱氢酶（GDH）溶液，奈替米星的活化，将GDH与奈替米星偶联，纯化偶联的酶标抗原。5.（2）奈替米星均相酶免疫检测试剂的制备：试剂1的制备：由奈替米星抗体和均相酶底物混合而成；试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-奈替米星偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。6.根据权利要求5所述的一种奈替米星免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：1）葡萄糖脱氢酶（GDH）溶液的制备称取5-30mg规格为100-300KU的GDH，室温溶解于5-10mLPBS缓冲液中；2）奈替米星的活化将如下化学品加入到烧杯中搅拌溶解：10-40mg奈替米星、10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：严芳芳，马运乐，张轩，王亚盟，
申请(专利权)人：太原瑞盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14