一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂制造技术

本发明专利技术之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂，包括试剂R1、试剂R2和标准品；试剂R1由甘氨酸、沙丁胺醇‑牛血清白蛋白复合物，调PH至8.6，加蒸馏水定容至 1000ml制成，所述试剂R2由甘氨酸、聚乙二醇6000、抗沙丁胺醇单抗交联胶乳、牛血请白蛋白、Proclin300，调PH至8.6，加蒸馏水定容至 1000ml制成，本发明专利技术组方科学合理，易生产制备，使用方便、安全、准确，可有效用于快速检测食品中的沙丁胺醇，确保食品安全，经济和社会效益显著。

A latex enhanced immunoturbidimetric assay for quantitative determination of salbutamol

The aim of the present invention is to provide a latex enhanced immunoturbidimetry reagent for the quantitative detection of salbutamol, including reagent R1, reagent R2 and standard product. The reagent R1 is composed of glycine and salbutamol bovine serum albumin complex, PH to 8.6, and distilled water is fixed to 1000ml, and the reagent R2 is composed of glycine and polyethylene glycol (60). 00. Anti salbutamol McAb cross-linked latex, bovine serum albumin, Proclin300, PH to 8.6, and distilled water to set up to 1000ml. The invention is scientific and reasonable, easy to produce, easy to use, safe and accurate, and can be used for rapid detection of salbutamol in food, and ensure food safety, economy and society. The benefit is remarkable.

【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂
本专利技术涉及食品安全检测，特别是一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂。
技术介绍
沙丁胺醇(salbutamol；SAL)，别名：羟甲叔丁肾上腺素，柳丁氨醇等。其剂型有片剂、胶囊剂、气雾剂及注射剂等，沙丁胺醇为选择性β2受体激动剂，能有效地抑制组胺等致过敏性物质的释放，防止支气管痉挛。适用于支气管哮喘、喘息性支气管炎、支气管痉挛、肺气肿等症。硫酸沙丁胺醇为白色或类白色的粉末，无臭，味微苦。该品在水中易溶，在乙醇中极微溶解，在三氯甲烷或乙醚中几乎不溶。其为选择性激动支气管平滑肌上的β2-受体，使支气管平滑肌松弛，从而解除支气管平滑肌痉挛。不良反应主要是对心脏及中枢神经系统的兴奋作用，如头痛、头晕、失眠，偶见肌肉和手指震颤、心悸、血压波动等。长期使用能产生耐药性，可能加重哮喘。剂型有硫酸沙丁胺醇片、硫酸沙丁胺醇注射液、硫酸沙丁胺醇胶囊、硫酸沙丁胺醇缓释片、硫酸沙丁胺醇缓释胶囊。其中硫酸沙丁胺醇片为白色片；硫酸沙丁胺醇注射液为无色澄明液体；硫酸沙丁胺醇缓释胶囊为硬胶囊，内容物为白色或类白色球形小丸；硫酸沙丁胺醇缓释片白色或类白色片。瘦肉精是一类药物统称，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。当它们以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解、抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。“沙丁胺醇”是“瘦肉精”的一种，全世界都在禁用。在动物实验中发现，沙丁胺醇会造成骨骼发育迟缓，唇颚裂等症状，代谢时间比莱克多巴胺长。毒物专家表示，“沙丁胺醇”比莱克多巴胺毒上2千倍。在动物实验中发现，“沙丁胺醇”会造成骨骼发育迟缓，唇颚裂等症状，代谢时间需要3天，也比莱克多巴胺还要久。2002年，农业部、原卫生部、原国家药品监督管理局联合发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)禁止使用克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等“瘦肉精”类物质在动物养殖中的使用。2011年12月5日，工信部、农业部、商务部、原卫生部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局六部委发布联合公告(2011年第41号)，要求即日起在我国境内禁止生产和销售克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。目前我国检测饲料、猪肌肉及其脏器、猪尿中沙丁胺醇的常规方法是酶联免疫(ELISA)法、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MSIMS)、气相色谱－质谱(GC-MS)法和胶体金免疫层析法。酶联免疫(ELISA)法定量检测沙丁胺醇其主要工作原理如下：利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有沙丁胺醇蛋白偶联物，加入待测沙丁胺醇标准品或样品溶液及特异性的抗沙丁胺醇的抗体，包被在微孔板上的沙丁胺醇蛋白偶联物和标准品或样品中的沙丁胺醇竞争性地与抗体结合；再加入酶标二抗，形成抗原抗体复合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的沙丁胺醇浓度与吸收光强度成反比。该方法操作步骤多，反应时间长，检测费用昂贵，不适于分析大批量的样品。高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MSIMS)法定量检测沙丁胺醇其主要工作原理如下：试样中的β-受体激动剂残留物经酶解，离心后将上清液调pH，用异丙醇-乙酸乙酯提取，再用MCX柱子净化，吹干浓缩后用高效液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。其中需要使用高效液相色谱仪(配荧光检测器)、冷冻离心机、振荡器、涡旋混合器、分析天平、旋转蒸发仪、氮吹仪一系列仪器设备。沙丁胺醇对照溶液和试液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算样品含量。该方法操作步骤繁琐，反应时间长，需要大量精密仪器和化学试剂，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。气相色谱－质谱法(GC-MS)定量检测沙丁胺醇其主要工作原理如下：试样中呈结合态的β-受体激动剂残留物在乙酸铵缓冲液中经酶解后成游离状态，调节提取液pH，然后用乙酸乙酯和异丙醇混合溶剂萃取，萃取液旋转蒸干后用乙酸铵缓冲液溶解，过阳离子交换柱。净化后的样品氮气吹干后用双三甲基三氟乙酰氨(BSTFA)衍生，然后选择离子模式进行在气相色谱－质谱仪上进行测定，内标法定量。该方法灵敏度高，但操作步骤繁琐，反应时间长，需要使用精密仪器，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。胶体金免疫层析方法(CIA)检测沙丁胺醇的主要工作原理：采用胶体金免疫层析技术和竞争抑制原理，将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内蛋白质标记形成胶体金免疫复合物的技术。检测时，样品中的沙丁胺醇在流动过程中与胶体金标记的特异性沙丁胺醇抗体结合，抑制了沙丁胺醇抗体与固相载体膜上的沙丁胺醇-BSA偶联物的结合，如果样品中含有沙丁胺醇时，则检测线T在规定时间内不显颜色，结果为阳性，反之，若检测线T显红色色带，结果为阴性。无论样品中沙丁胺醇浓度高低，C线均显红色色带。该方法操作方便，检测时间短，但是，只能对样品进行定性检测，不能实现对样品定量检测和动态监测，满足不了对沙丁胺醇检测的实际需要。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂，可有效解决快速、准确、定性与定量的动态监测食品中是否含有沙丁胺醇，确保食品安全的问题。本专利技术解决的技术方案是，本专利技术试剂包括试剂R1、试剂R2和标准品；所述的试剂R1由甘氨酸3.75-15.01g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物0.2-1.1g，调PH至8.6，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物的制备方法是：沙丁胺醇150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm；反应后真空抽干反应物中的吡啶；沉淀物溶解于8ml由二甲基甲酰胺(DMF)与1,4-二恶烷按体积比1:1配制成的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，2-4℃下反应1h，随后将该反应液逐滴加入10ml，4℃预冷的质量浓度为0.2％的牛血清白蛋白溶液，4℃反应48小时，反应物在pH7.2磷酸缓冲盐溶液(PBS)中透析48小时，透析期间，每4小时换磷酸缓冲盐溶液一次，除去未反应的试剂，成沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物；所述试剂R2由甘氨酸3.75-15.01g、聚乙二醇600010-30g、抗沙丁胺醇单抗交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白(BSA)10-30g、Proclin3001-5ml，调PH至8.6，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，抗沙丁胺醇单抗交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒直径50-500nm，溶于pH6.5,50mM10ml的2-吗啉乙磺酸(MES)中，得胶乳溶液，再将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)20mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂，其特征是：本专利技术试剂包括试剂R1、试剂R2和标准品；所述的试剂R1由甘氨酸 3.75‑15.01g、沙丁胺醇‑牛血清白蛋白复合物 0.2‑1.1g，调PH至8.6，加蒸馏水定容至 1000ml制成，其中，沙丁胺醇‑牛血清白蛋白复合物的制备方法是：沙丁胺醇150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm；反应后真空抽干反应物中的吡啶；沉淀物溶解于8ml由二甲基甲酰胺（DMF）与1,4‑二恶烷按体积比1:1配制成的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，2‑4℃下反应1h，随后将该反应液逐滴加入10ml，4℃预冷的质量浓度为0.2%的牛血清白蛋白溶液，4℃反应48小时，反应物在pH7.2磷酸缓冲盐溶液（ PBS）中透析48小时，透析期间，每4小时换磷酸缓冲盐溶液一次，除去未反应的试剂，成沙丁胺醇‑牛血清白蛋白复合物；所述试剂R2由甘氨酸 3.75‑15.01g、聚乙二醇6000 10‑30 g、抗沙丁胺醇单抗交联胶乳 100‑600mg、牛血清白蛋白（BSA）10‑30 g、Proclin300 1‑5 ml，调PH至8.6，加蒸馏水定容至 1000ml制成，其中，抗沙丁胺醇单抗交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20‑200mg，胶乳颗粒直径50‑500nm，溶于pH6.5,50mM 10ml 的2‑吗啉乙磺酸（MES）中，得胶乳溶液，再将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC） 20mg、N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS） 20mg依次加入上述胶乳溶液中，震荡反应1h成活化胶乳，随后22000rpm下离心40分钟，弃去上清液，沉淀使用pH6.5、浓度为50mM的2‑吗啉乙磺酸（MES）10ml复溶，重复离心二次，弃去上清液；沉淀溶于10ml 0.01M 的pH7.2磷酸缓冲盐溶液（ PBS）中，成活化胶乳；(2)活化胶乳每毫升中加入400μg抗沙丁胺醇单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时，成反应液，反应液每毫升中加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液500μl，继续室温搅拌反应2小时 ；20000rpm下离心40分钟，弃去上清液，沉淀用0.05M ，pH 8.6 的甘氨酸缓冲液复溶成抗沙丁胺醇抗体羧基胶乳交联的羧基胶乳溶液；标准品制备方法：（1）pH 7.4 0.01M磷酸缓冲盐溶液（ PBS）的配制：将磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾 0.24g，氯化钠8 g，氯化钾0.2g用蒸馏水溶解、混匀，定容至1000ml，用盐酸或氢氧化钠调pH值至7.4，备用；（2）标准品的配制：将质量纯度99.5%的沙丁胺醇（购自中国药品生物制品鉴定所对照品）1mg，用pH7.4 ，0.01M磷酸缓冲盐溶液（ PBS）完全溶解，定容至浓度100μg/ml；取10μL ，100μg/ml沙丁胺醇标准品，用pH7.4， 0.01M磷酸缓冲盐溶液（ PBS）定容至浓度100ng/ml；取4mL浓度为 100ng/ml的沙丁胺醇溶液，用pH7.4， 0.01M磷酸缓冲盐溶液（ PBS）定容至浓度4.0ng/ml的标准品。...

【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂，其特征是：本发明试剂包括试剂R1、试剂R2和标准品；所述的试剂R1由甘氨酸3.75-15.01g、沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物0.2-1.1g，调PH至8.6，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物的制备方法是：沙丁胺醇150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm；反应后真空抽干反应物中的吡啶；沉淀物溶解于8ml由二甲基甲酰胺（DMF）与1,4-二恶烷按体积比1:1配制成的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，2-4℃下反应1h，随后将该反应液逐滴加入10ml，4℃预冷的质量浓度为0.2%的牛血清白蛋白溶液，4℃反应48小时，反应物在pH7.2磷酸缓冲盐溶液（PBS）中透析48小时，透析期间，每4小时换磷酸缓冲盐溶液一次，除去未反应的试剂，成沙丁胺醇-牛血清白蛋白复合物；所述试剂R2由甘氨酸3.75-15.01g、聚乙二醇600010-30g、抗沙丁胺醇单抗交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30g、Proclin3001-5ml，调PH至8.6，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，抗沙丁胺醇单抗交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒直径50-500nm，溶于pH6.5,50mM10ml的2-吗啉乙磺酸（MES）中，得胶乳溶液，再将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）20mg、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）20mg依次加入上述胶乳溶液中，震荡反应1h成活化胶乳，随后22000rpm下离心40分钟，弃去上清液，沉淀使用pH6.5、浓度为50mM的2-吗啉乙磺酸（MES）10ml复溶，重复离心二次，弃去上清液；沉淀溶于10ml0.01M的pH7.2磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，成活化胶乳；(2)活化胶乳每毫升中加入400μg抗沙丁胺醇单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时，成反应液，反应液每毫升中加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液500μl，继续室温搅拌反应2小时；20000rpm下离心40分钟，弃去上清液，沉淀用0.05M，pH8.6的甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑蓬举，刘昊旻，王威风，张倩茹，苟丽丽，
申请(专利权)人：河南联博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41