本发明专利技术公开了一种基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒，其包括：试剂A，所述试剂A为pH＝8.0～9.4的甘氨酸缓冲体系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚剂、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质；以及试剂B，所述试剂B为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5～10mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质。本发明专利技术还公开了制备试剂B的方法。所述试剂盒可用于人IgM的测定，可有效避免非特异性反应，检测灵敏度较高，且具有较低的检测限。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒及其制备方法。
技术介绍
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)。自新生婴儿至成人，血清中IgM浓度逐由5～30mg/dL升高至40～345mg/L。血清中IgM浓度出现异常时可能某些疾病有关。比如IgM的偏高与胎儿宫内感染，新生儿TORCH症群，慢性或亚急性感染，疟疾，传染性单核细胞增多症，支原体肺炎，肝病，结缔组织疾病，巨球蛋白血症，无症状性单克隆IgM病等有关，而IgM的偏低则与遗传性或获得性抗体缺乏症，混合性免疫缺陷综合症，选择性IgM缺乏症，蛋白丢失性肠病，烧伤，抗Ig抗体综合症(混合性冷球蛋白血症)，免疫抑制剂治疗等有关。IgM的检测作为临床诊断的指标，在疾病预防和诊断治疗方面具有重要义。现有技术中检测IgM的方法主要有免疫比浊法和放射免疫扩散法等，其中免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，操作相对简单、成本低，在生化分析仪上使用较为广泛。免疫比浊法可分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中在高分子促聚剂(聚乙二醇等)的作用下聚合析出直径为340nm～700nm的颗粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。当入射光照射不同浊度的反应液时可被不同程度的吸收、反射和折射，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可得出检样中抗原的含量。在普通的免疫透射比浊法或免疫散射比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间，但检测的灵敏度会较低，而加大抗体抗原的用量又会增加检测成本，而且不符合微量化的要求。基于此，现有技术中公开有胶乳增强免疫比浊法即胶乳免疫比浊法，其原理是将与待测物质相对应的抗体包被在一定直径的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的灵敏度。但是在胶乳免疫比浊法中，添加的高分子促聚剂虽然可以使抗体更容易结合抗原，但是同时也会使抗体结合其他物质，导致非特异性增强；而且活化胶乳亦使得抗体本身的反应性显著增加，增多超量的高分子促聚剂，会使更多的胶乳聚集，进一步促进非特异性反应，结果容易导致聚集的胶乳颗粒粒径不均匀，反应重现性低，检测时的特征波长不固定。而在临床使用过程中，参数都是固定的，特征波长的变动使得该技术在实际临床应用中有一定局限性，现有的测定IgM的胶乳免疫比浊法用的试剂盒的检测限较高，对低浓度(低于30mg/dL)的样本的检测效果不理想。另外，现有的胶乳免疫比浊法所用的胶乳在制备过程中需要分离过量的EDC、NHS等活化试剂，而且需要进行封闭处理，操作上较为繁琐。
技术实现思路
因此，针对现有技术中用胶乳免疫比浊法测定IgM时易出现非特异性反应、检测限较高的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种可有效避免非特异性反应的，且检测灵敏度高、检测限低的基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒。本专利技术的基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒包括：试剂A，所述试剂A为pH＝8.0～9.4的甘氨酸缓冲体系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚剂、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质；以及试剂B，所述试剂B为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5～10mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质。所述胶乳为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，是粒径为30～80nm优选40～50nm的羧基微球经NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)活化后再由羊抗人IgM多克隆抗体包被得到的乳胶；所述胶乳中，羧基微球的浓度为1～2g/L优选1g/L，NHS与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1，EDC与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1，包被用的羊抗人IgM多克隆抗体与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1。优选的，所述试剂A和所述试剂B分别还含有0.5～1g/L的防腐剂，所述防腐剂为proclin300和/或叠氮钠。优选的，所述试剂A中的高分子促聚剂为聚乙二醇6000，聚乙二醇6000在所述试剂A中的浓度为0.2～0.5g/L；所述试剂A和所述试剂B中的表面活性剂均为曲拉通X100；所述试剂A和所述试剂B中的电解质均为氯化钠。本专利技术的一较佳实施例的所述试剂A为pH＝8.6的100mmol/L甘氨酸缓冲体系，含有0.5g/L的聚乙二醇6000、1g/L的曲拉通X100、5g/L的氯化钠和1g/L的叠氮钠。本专利技术的一较佳实施例的所述试剂B为pH＝6.8的50mmol/L MES缓冲体系，含有2.8g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1g/L的曲拉通X100、5g/L的氯化钠和1g/L的叠氮钠。本专利技术另一目的还在于公开一种制备试剂B的方法，所述试剂B为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5～10mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质；该方法包括如下步骤：1)用pH＝6.5～7.3的MES缓冲液将羧基微球稀释至1～2g/L，再加入NHS和EDC，15～25℃下反应20～30分钟得到活化胶乳；2)向活化胶乳中加入包被用的羊抗人IgM多克隆抗体，在25～37℃下振摇孵育2～4小时，制得羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳；3)根据所述试剂B的各组分浓度，向pH＝6.5～7.3的MES缓冲液中加入表面活性剂、电解质和羊抗人IgM多克隆抗体，然后加入步骤2)制得的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳；4)用0.2μL尼龙膜过滤除菌和大颗粒，得试剂B。步骤1)中的羧基微球粒径为30～80nm优选40～50nm；NHS与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1，EDC与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1；步骤2)中，包被用的羊抗人IgM多克隆抗体与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1。步骤2)和步骤3)中加入的羊抗人IgM多克隆抗体预先用pH＝6.5～7.3的MES缓冲液稀释至20～30g/L。步骤3)中，还添加有防腐剂proclin300和/或叠氮钠，所述防腐剂添加浓度为0.5～1g/L。本专利技术的关键技术及积极进步效果在于：1、本专利技术的一关键技术是试剂B中控制羊抗人IgM多克隆抗体与活化胶乳中的羧基微球的质量比例为200～400:1，同时羧基微球的粒径为30～80nm尤其是40～50nm，使少量包被用抗体与羧基微球结合，这样便形成了普通抗体和携带羧基微球的包被抗体的混合体，而且通过0.2μL膜过滤去除聚集的微球。当加入抗原时，抗原就会按照比例与这两种抗体结合，聚集形成的颗粒物就会包含1个或几个羧基微球，反应的性能大大增加，尽可能避免非特异性反应。2、本专利技术另一关键技术是高分子促聚剂的用量，浓度为0.1～0.5g\本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂A，所述试剂A为pH＝8.0～9.4的甘氨酸缓冲体系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚剂、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质；以及试剂B，所述试剂B为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5～10mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质。
【技术特征摘要】
1.一种基于胶乳免疫比浊法的IgM试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂A，所述试剂A为pH＝8.0～9.4的甘氨酸缓冲体系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚剂、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质；以及试剂B，所述试剂B为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgM多克隆抗体、5～10mL/L的羊抗人IgM多克隆抗体包被的胶乳、1～10g/L的表面活性剂和0.5～10g/L的电解质。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳为pH＝6.5～7.3的MES缓冲体系，是粒径为30～80nm优选40～50nm的羧基微球经NHS和EDC活化后再由羊抗人IgM多克隆抗体包被得到的胶乳；所述胶乳中，羧基微球的浓度为1～2g/L优选1g/L，NHS与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1，EDC与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1，包被用的羊抗人IgM多克隆抗体与羧基微球的质量比为0.05～0.1:1。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A和所述试剂B分别还含有0.5～1g/L的防腐剂，所述防腐剂为proclin300和/或叠氮钠。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A中的高分子促聚剂为聚乙二醇6000，聚乙二醇6000在所述试剂A中的浓度为0.2～0.5g/L；所述试剂A和所述试剂B中的表面活性剂均为曲拉通X100；所述试剂A和所述试剂B中的电解质均为氯化钠。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为pH＝8.6的100mmol/L甘氨酸缓冲体系，含有0.5g/L的聚乙二醇6000、1g/L的曲拉通X100、5g/L的氯化钠和1g/L的叠氮钠。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂B...
【专利技术属性】
技术研发人员：王军峰，陈小星，孟菲，
申请(专利权)人：上海执诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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