本发明专利技术提供了一种基于金‑石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用，该电化学生物传感器的制备方法包括：称取原料一水合柠檬酸、组氨酸和色氨酸加入去离子水得到反应液，将反应液放入烘箱内反应，反应结束后得到组氨酸和色氨酸功能化石墨烯量子点，其作为稳定剂和还原剂与氯金酸溶液一步法反应合成金‑组氨酸和色氨酸石墨烯杂合物，基于该杂合材料构建了无酶循环扩增电化学DNA传感器；本发明专利技术的电化学生物传感器通过发夹自组装，通过金/石墨烯量子点和无酶循环扩增的双重信号放大策略，使得该电化学传感器检测循环DNA具有超高的灵敏度，达到检测限低至亚皮摩尔水平；同时其检测重复性好，稳定性优良。
【技术实现步骤摘要】
基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用
本专利技术属于电化学生物传感器
，具体涉及一种基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用。
技术介绍
循环肿瘤DNA（ctDNA）是随细胞凋亡、坏死而释放到外周血、脑脊液等体液中的，由肿瘤原发灶或循环肿瘤细胞衍生的单链或双链DNA片段。多项研究表明，ctDNA作为一种极具临床应用前景的肿瘤生物标记物，在肿瘤评估等方面备受关注。例如，KRAS基因点突变与包括肺癌、结直肠癌和卵巢癌等在内的多种癌症密切相关。因此，ctDNA的定量分析在肿瘤的早期诊断、病程进展和预后监测等方面发挥着至关重要的作用。然而，ctDNA定量检测面临的最大挑战是体液中的ctDNA含量极低，需要极高的灵敏度才能实现定量分析与检测。目前，ctDNA的分析方法主要有无酶PCR反应、DNA测序、基因芯片和酶辅助的PCR扩增，这些技术相对成熟，却仍然存在诸多不足。基于无酶PCR的技术，如数字PCR和微滴式数字PCR（ddPCR），已成功应用于ctDNA检测，却易被化学物质影响而产生假阴性或假阳性。DNA测序是检测基因突变的金标准技术，但具有仪器设备昂贵、耗时长等不可避免的缺点。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。但是，该技术成本昂贵、复杂，检测灵敏度较低，重复性差，分析泛围较狭窄。为了提高检测灵敏度，各种酶辅助信号扩增方法包括滚环扩增（RCA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）和指数扩增反应已被用来克服标准PCR技术的局限性，在这些策略中使用酶可以显著提高检测灵敏度，但是，它可能会导致非特异性和假阳性信号，同时酶又是很昂贵的，并且控制反应条件以确保最佳的酶活性是具有挑战性的。因此，亟需发展一种经济实用、简单快速、灵敏度高的ctDNA分析方法以适应临床诊断治疗需要。电化学DNA传感器因其具有高灵敏度、高特异性、低成本和良好便携性等独特优点吸引了国内外研究者的广泛兴趣，已经成为包括临床诊断、微生物检测和环境监测等许多重要领域的定量分析工具。在经典核酸传感器中，生物识别过程涉及互补核酸链碱基之间的非共价相互作用，表现为捕获探针和互补靶标序列之间的杂交。固定化核酸可以是茎环探针（SLP），也可以是线形探针（LP）。对于典型电化学DNA生物传感器的构建，一般将DNA识别探针固定在电极上，通过特异性杂交捕获靶标DNA分子，随后传感器将相应变化转换成电化学信号。目前，对于肿瘤细胞中的标志物循环DNA的检测大部分都是采用基因芯片，PCR扩增的手段进行检测，而使用电化学DNA传感器的检测报道很少。为了进一步提高电化学DNA生物传感器的灵敏度，近年来已使用了纳米材料，如中孔二氧化硅，金属纳米材料和石墨烯等。石墨烯量子点不仅继承了石墨烯的优点，而且具有独特的小粒径，丰富的边缘位点和各种官能团，对电解质离子有很强的吸附能力，因而在电化学领域展现出巨大的发展潜质。特殊功能化的石墨烯量子点还具有还原性，利用其作为还原剂与贵金属纳米粒子紧密结合。石墨烯量子点与贵金属的结合可以实现优势互补和相互协同。石墨烯量子点表面的疏水基团可以避免贵金属纳米粒子的聚集。不掺杂杂原子的石墨烯量子点的电活性显著下降，而贵金属纳米材料具有卓越的电导率和优异的电催化能力，两者结合后的复合材料不仅具有良好的电学性质，且具有良好的空间结构和形貌特征，能有效提高检测物的分析灵敏度。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术的首要目的是提供一种基于金-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用，即为了弥补传统检测方法的缺陷，本专利技术构建了无酶循环扩增的电化学DNA传感器用于ctDNA的超灵敏检测。本专利技术的第二个目的是提供上述基于金-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法。为达到上述首要目的，本专利技术的解决方案是：一种基于金-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器在检测细胞中循环肿瘤DNA中的应用。为达到上述第二个目的，本专利技术的解决方案是：一种上述的基于金-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器的制备方法，其包括如下步骤：（1）、称取摩尔比3:1:2的柠檬酸、组氨酸和色氨酸混合均匀，加入蒸馏水后超声10-30min溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，设置温度为150-200℃，加热反应0.5-2h，反应结束后得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点固体产物，并配制成20-100mg/mL的水溶液，然后将配制的水溶液用0.25μm的滤膜过滤2h得到粒径均一的组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液；（2）、将2-20mL浓度为0.2-1mg/mL的氯金酸溶液在60-100℃水浴锅下加热至沸腾，然后加入步骤（1）的0.1-0.5mL组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液中，该溶液迅速由微黄色变成红色，反应在1min之内完成，之后将反应结束的溶液经过3000-10000rpm离心5-30min，过滤，收集得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物（HT-GQDs/Au），用超纯水清洗2-5次，然后分散在0.5-2.0mL、pH值为6.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液中，得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金储备液；（3）、配制DNA储备液：将20-50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）、1-5mmol/L的氯化镁（MgCl2）、1-5mmol/L的氯化钙（CaCl2）、2-20mmol/L的氯化钾（KCl）和目标DNA反应得到DNA储备液，pH值为7.0-8.0；（4）、将定制DNA的H2序列（用于与目标DNA反应的探针）和定制DNA的H1序列（用于与H2反应的发夹探针）分别溶解在步骤（3）的DNA储备液中，将溶解的H1序列和H2序列在60-100℃下加热5-20min，并以1℃/min的速率缓慢冷却至室温，形成稳定的H1发夹结构和H2发夹结构；称取0.01-0.1g的硫堇加入1-10mL的步骤（3）的DNA储备液中，得到0.01-0.1g/mL的硫堇（Thi）溶液；（5）、将步骤（4）中H1发夹结构和H2发夹结构分别加入10-100μL的1-10mmol/L盐酸三-（2-羧乙基）膦（TCEP）溶液以激活发夹中的巯基基团，得到巯基（-SH）基团活化的H1发夹溶液和H2发夹溶液；将H2发夹溶液与步骤（2）0.1-1mL的组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金（HT-GQDs/Au）储备液混合，得到第一混合液，将1-10mol/L的氯化钠（NaCl）和1-10%的十二烷基硫酸钠（SDS）分别加入第一混合液中，得到含有0.1-1mol/L的氯化钠（NaCl）和0.01-0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的第二混合液，并将第二混合液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中循环肿瘤DNA中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中循环肿瘤DNA中的应用。
2.一种如权利要求1所述的基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）、称取摩尔比3:1:2的柠檬酸、组氨酸和色氨酸混合，加入蒸馏水后超声10-30min溶解得到反应液，将所述反应液加热反应，得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点固体产物，并配制成水溶液，然后过滤2h得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液；
（2）、将2-20mL浓度为0.2-1mg/mL的氯金酸溶液在60-100℃下加热至沸腾，然后加入步骤（1）的所述组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液中，离心，之后过滤得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物，清洗之后分散在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金储备液；
（3）、将三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、氯化钙、氯化钾和目标DNA反应得到DNA储备液，pH值为7.0-8.0；
（4）、将定制DNA的H2序列和定制DNA的H1序列分别溶解在步骤（3）的DNA储备液中，将溶解的H1序列和H2序列加热，并以1℃/min的速率冷却至室温，形成稳定的H1发夹结构和H2发夹结构；将硫堇加入步骤（3）的DNA储备液中，得到硫堇溶液；
（5）、将步骤（4）中H1发夹结构和H2发夹结构分别加入盐酸三-（2-羧乙基）膦溶液以激活发夹中的巯基基团，得到巯基基团活化的H1发夹溶液和H2发夹溶液；将所述H2发夹溶液与步骤（2）中的组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金储备液混合，得到第一混合液，将氯化钠和十二烷基硫酸钠依次加入所述第一混合液中，得到含有氯化钠和十二烷基硫酸钠的第二混合液，并将所述第二混合液孵育，然后离心，用步骤（3）的DNA储备液洗涤2-5次，去除未反应的物质，将收集的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物固体重新分散在步骤（3）中的DNA储备液中，最后将此溶液超声得到H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液；
（6）、将步骤（5）中H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液中，然后在空气浴振动器中孵育50-120min，得到活化的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液，将所述活化的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液加入步骤（4）的硫堇溶液中，然后在空气浴振动器中孵育6-20h，之后离心收集，得到H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇固体，并用步骤（3）的DNA储备液洗涤2-5次，将清洗的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇固体再分散在步骤（3）的DNA储备液中，然后...
【专利技术属性】
技术研发人员：王青泉，朱荫华，储红霞，张璇，申文君，扈金舟，张秀丽，李宝玉，
申请(专利权)人：上海执诚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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