右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用及其试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用及其试剂盒和检测方法，通过在环介导等温扩增体系中加入右旋糖苷至终浓度为0.1～0.5mol/L(以葡萄糖计)，提高了聚合酶的稳定性，可部分替代普通LAMP试剂盒中价格昂贵的“聚合酶”和“甜菜碱”，可很好的促进高含量GC片段的扩增，可以将检测反应时间减少到20‑30分钟，能够降低检测成本同时缩短检测周期，对环介导等温扩增在病原微生物中检测具有重要意义。

Application of dextran in loop mediated isothermal amplification for detection of Haemophilus rhinitis in chicken and its kit and detection method

The invention relates to a dextran in the loop mediated isothermal amplification detection of chicken rhinitis Haemophilus paragallinarum and application kit and the detection method, based on loop mediated isothermal amplification system with dextran to a final concentration of 0.1 ~ 0.5mol/L (as glucose), improve the polymerase stability, can partially replace the ordinary LAMP kit in expensive \by\ and \GB\, can be very good to promote the high content of GC amplification can be detected, the reaction time is reduced to 20 30 minutes, can reduce the cost and shorten the test cycle, the loop mediated isothermal detection plays an important role in the amplification of pathogenic microorganism.

【技术实现步骤摘要】
右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用及其试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物
，涉及右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用，还涉及含有右旋糖苷的试剂盒和检测方法。
技术介绍
目前，原微生物的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法，但分离培养鉴定法操作繁琐、费时，PCR法和FQ-PCR法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合中小型单位和现场检测应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术与其它核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但扩增过程中仍需要价格较高的DNA聚合酶，如果能减少DNA聚合酶的使用量将对进一步降低病原微生物检测成本具有重要意义。副鸡嗜血杆菌为革兰氏阴性杆菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。由其引起的鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌病是危害鸡、火鸡和山鸡等家禽和野禽的一种接触性传染病。该病发病率和死亡率通常在10～30％，但有的鸡场感染鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的病鸡死亡率高达75％。一旦某地区的鸡群发生鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌感染，该病就会成为地方性疾病，很难彻底根除，并且经常反复爆发，带来巨大的经济损失。鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌感染以引起慢性萎缩性鼻炎，有恶臭，以及败血症、泌尿系感染等为主要病理特征，在病理学上很难与其它细菌性鼻炎感染进行区别。因此有必要建立一种低成本的检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌病的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供右旋糖苷在环介导等温扩增中降低聚合酶使用量或/和缩短反应时间中的应用；本专利技术的目的之二在于提供含有右旋糖苷的环介导等温扩增的检测试剂盒，灵敏度高，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位和现场检测应用；本专利技术的目的之三在于提供所述的试剂盒在鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌基于环介导等温扩增检测中的应用；本专利技术的目的之四在于提供基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下检测方案：1、右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中降低聚合酶使用量或/和缩短反应时间中的应用。2、含有右旋糖苷的环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的试剂盒，包括如下组分：环介导等温扩增内引物和外引物，嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱、右旋糖苷和荧光染料赛博绿Ⅰ；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为150-250mmol/L、pH为8.5-8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为50-100mmol/L的氯化钾、浓度为50-100mmol/L的硫酸铵、浓度为15-20mmol/L的硫酸镁和质量分数为0.5-1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成；所述环介导等温扩增内引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述外引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。优选的，所述环介导等温扩增内引物浓度分别为5μmol/L；所述外引物浓度分别为20μmol/L。优选的，所述嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶浓度为4U/μl、所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物各组分浓度为10mmol/L、硫酸镁浓度为100mmol/L、甜菜碱浓度为2mol/L、右旋糖苷浓度为4mol/L和荧光染料赛博绿Ⅰ质量分数为10％。优选的，所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris–HCl、浓度为100mmol/L的氯化钾、浓度为100mmol/L的硫酸铵、浓度为20mmol/L的硫酸镁和质量分数为1％的TritonX-100组成。2、所述的试剂盒在基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中的应用。3、基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的方法，包括以下步骤：a、提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；b、鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的环介导等温扩增：在反应管中配制环介导等温扩增反应体系，各组分终浓度如下：浓度各为0.1-0.2μmol/L的内引物，浓度各为0.5-0.8μmol/L的外引物，3～4U嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为0.5-1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为2-3mmol/L的硫酸镁，浓度为0.5-1mol/L的甜菜碱，浓度为0.1～0.5mol/L的右旋糖苷，待检模板DNA水溶液0.5-1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应20～30分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；所述内引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述外引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次将右旋糖苷用于环介导等温扩增，能够显著提高酶的热稳定性的，使用浓度不大于0.5M时(以葡萄糖计)，可部分替代普通LAMP试剂盒中(一半左右)价格昂贵的“聚合酶”和“甜菜碱”，可很好的促进高含量GC片段的扩增，可以将检测反应时间减少到20-30分钟，不仅节约成本，还缩短检测周期，对环介导等温扩增具有重要意义。本专利技术还公开含有右旋糖苷的试剂盒，该试剂盒鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌16SrRNA(GenbankAccessionNo.EU376364)保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，从而保证了检测结果的可靠性；本专利技术基于环介导等温扩增技术检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌，由四条引物对靶序列的六个特异区域进行识别，特异性强；在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间损失，耗时短，在1小时内即可将靶序列扩增至109倍，而且受非靶序列的影响小，与PCR法相比灵敏度更高，检测限仅为几个拷贝；此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，操作简便快速，检测成本低。本专利技术的试剂盒及方法特别适合中小型单位和现场检测应用。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为环介导等温扩增技术检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌结果(1：空白对照；2：对比检测1；3：实验组；4：对比检测2)。图2为特异性实验结果(1：绿脓杆菌；2：金黄色葡萄球菌；3：沙门氏菌；4：鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌)。图3为敏感性实验结果(P：阴性对照；1：10-1；2：10-2；3：10-3；4：10-4；5：10-5；6：10-6；7：10-7；8：10本文档来自技高网...

【技术保护点】
右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中降低聚合酶使用量或/和缩短反应时间中的应用。

【技术特征摘要】
1.右旋糖苷在环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌中降低聚合酶使用量或/和缩短反应时间中的应用。2.含有右旋糖苷的环介导等温扩增检测鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：环介导等温扩增内引物和外引物，嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱、右旋糖苷和荧光染料赛博绿Ⅰ；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为150-250mmol/L、pH为8.5-8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为50-100mmol/L的氯化钾、浓度为50-100mmol/L的硫酸铵、浓度为15-20mmol/L的硫酸镁和质量分数为0.5-1％的曲拉通X-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成；所述环介导等温扩增内引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述外引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增内引物浓度分别为5μmol/L；所述外引物浓度分别为20μmol/L。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述嗜热乳酸枯草芽孢杆菌DNA聚合酶浓度为4U/μl、所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物各组分浓度为10mmol/L、硫酸镁浓度为100mmol/L、甜菜碱浓度为2mol/L、右旋糖苷浓度为4mol/L和荧光染料赛博绿Ⅰ质量分数为10％。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/L、pH为8.8的Tris–H...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金龙，殷素会，戴茜茜，许国洋，周婵，王海燕，谷山林，王介平，吕金凤，王小燕，李晋，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50