本发明专利技术公开了OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用，属于水稻基因工程领域。本发明专利技术主要是通过CRISPR/Cas9系统对OsKTN80b基因进行基因编辑，获得OsKTN80b基因敲除的转基因植株，从中选择纯合突变体，最终获得株高降低的植株。本发明专利技术还公开了用于OsKTN80b基因敲除的2个靶点序列SG1或SG2，分别由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成。与野生型水稻相比，本发明专利技术OskTN80b基因敲除的转基因植株的株高降低了13.56％‑16.33％，其降低水稻株高的效果好；其次，本发明专利技术方法不受遗传背景限制，也不存在与不良性状连锁的问题。
The application of OsKTN80b gene in the rice plant height decreased
The invention discloses the application of OsKTN80b gene in reducing the plant height of rice, belonging to the field of rice gene engineering. The present invention mainly uses CRISPR/Cas9 system to edit OsKTN80b gene, obtains transgenic plants with OsKTN80b gene knockout, selects homozygous mutants from them, and finally obtains plants with lower plant height. The invention also discloses a OsKTN80b gene knock 2 target sequences of SG1 or SG2 except for composition of nucleotide sequences are shown by SEQ ID and SEQ No.4 ID No.5. Compared with the wild type rice, transgenic plants of the invention OskTN80b gene knockout strains of high 13.56% decreased 16.33%, reduce the effect of high rice strains; secondly, the method of the invention is not affected by genetic background, problem does not exist with the bad characters of chain.
【技术实现步骤摘要】
OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用
本专利技术涉及水稻基因工程领域，具体涉及OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的用途。
技术介绍
20世纪60年代，矮秆水稻育种的成功，使水稻产量提高了20％-30％，被称为水稻育种的“绿色革命”。矮化育种不仅提高了水稻的抗倒伏能力，而且对于增加种植密度、改善水稻的综合性状都有重要的作用。目前，生产上应用的水稻矮杆基因主要是sd1，存在矮秆基因单一和遗传背景狭窄等缺点，很容易造成遗传上的脆弱性和局限性。此外，其他已知的矮杆和半矮杆基因大多对水稻农艺性状有负面影响，即含有这些矮秆基因的水稻品种农艺性状较差，在实际生产中很难应用，因而限制了水稻矮化育种的发展。随着生物技术的发展，转基因技术为水稻的矮化育种提供了一种新的途径。目前，已克隆了20多个矮杆及相关基因，其中大部分矮杆基因参与赤霉素(GA)的合成、运输及信号转导途径，如sd1(SasakiA等，Nature,2002,416(416):701-702；MonnaL等，DNAResearch,2002,9(1):11；WolfgangSpielmeyer等，ProceedingsoftheNationalAcademyofScience,2002,99(13):9043-9048)、D1(FujisawaY等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1999,96(13):7575-7580)、BC12/GDD1(LiJ等，PlantCell，2011,23(2):628-640)、OsSPY(ShimadaA等，PlantJournal,2006,48(3):390-402)、D35(ItohH等，PlantMolecularBiology,2004,54(4):533)、D18(TongH等，PlantCell,2014,26(11):4376)、EUI1(ZhuY等，PlantCell,2006,18(2):442-456)、GID1(TanakaN等，PlantCell&Environment，2006，29(4):619-631)和GID2(SasakiA等，Science，2003，299(5614):1896-1898)等。这些矮杆基因中，除sd1以外，大多具有“一因多效”的遗传表型，矮化的同时伴随着不利的农艺性状，难以在实际生产中应用。OsKTN80b是编码微管剪切酶蛋白的基因(WanL等.JournalofIntegrativePlantBiology,2014,56(7):622-634)。CRISPR/Cas9系统是一种准确、便捷、高效率的生物基因组编辑工具。该系统仅需要短的gRNA和核酸酶(Cas9)就可以进行特定的生物靶基因的编辑。目前，CRISPR/Cas9系统已在拟南芥、烟草、水稻、小麦、高粱、玉米等植物中实现了定点基因组编辑。
技术实现思路
本专利技术人在蜀恢498背景的EMS诱变突变体库中意外发现一种小粒突变体材料，通过全基因组重测序和MutMap定位分析，得到5个候选基因，包括编码微管剪切蛋白p80亚基OsKTN80b的LOC_Os04g58130基因；对候选基因OsKTN80b进行CRISPR/Cas9基因编辑敲除后，意外发现该基因在调控水稻株高方面的功能。本专利技术是在上述意外发现的基础上完成的，本专利技术目的在于提供OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的用途。本专利技术另一目的在于提供用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列。本专利技术第三目的在于提供上述靶点序列在降低水稻株高方面的用途。本专利技术第四目的在于提供用于敲除水稻OsKTN80b基因的sgRNA。本专利技术第五目的在于提供上述sgRNA在降低水稻株高方面的用途。本专利技术第六目的在于提供通过敲除OsKTN80b基因降低水稻株高的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用。所述的OsKTN80b基因由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成。所述的OsKTN80b基因，其编码的蛋白质由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成。所述的OsKTN80b基因，其基因组序列由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列组成。本专利技术还提供了用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列，所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合；其中所述的SG1由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQIDNo.5所示的核苷酸序列组成；即SG1：5’-CAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQIDNo.4)；SG2：5’-TTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQIDNo.5)。本专利技术还提供了上述靶点序列在降低水稻株高方面的应用。上述应用中所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合。本专利技术还提供了用于敲除水稻OsKTN80b基因的sgRNA，所述的sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合。上述sgRNA在降低水稻株高方面的应用。本专利技术还提供了通过敲除水稻OsKTN80b基因降低水稻株高的方法，所述的敲除水稻OsKTN80b基因是通过CRISPR/Cas9系统实现的。上述方法中所述的CRISPR/Cas9系统中，其sgRNA的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合，其中所述的SG1由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQIDNo.5所示的核苷酸序列组成。与现有技术相比，本专利技术具有的优点和有益效果：(1)、与野生型水稻相比，本专利技术OskTN80b基因敲除的转基因植株的株高降低了13.56％-16.33％，其降低水稻株高的效果好，为水稻矮秆育种提供了一个新的途径。(2)、本专利技术方法不受遗传背景限制，也不存在与不良性状连锁的问题，通过基因工程方法可以将该基因应用到水稻矮化育种中，用以获得水稻理想株型，增加种植密度，提高水稻产量。(3)本专利技术OskTN80b基因为水稻株高遗传研究提供了很好的研究材料。附图说明图1为OsKTN80b基因CRISPR/Cas9敲除载体质粒电泳图；其中1为OsKTN80b基因第一个靶位点SG1的CRISPR/Cas9敲除载体；2为OskTN80b基因第二个靶位点SG2的CRISPR/Cas9敲除载体；M为Trans2kPlusDNAMarker。图2为T0代转基因植株潮霉素检测电泳图谱；其中M为Marker，1-10为靶位点SG1的T0代植株,11-19代表靶位点SG2的T0代植株。图3为敲除植株包含靶位点一的PCR扩增测序的部分电泳图谱；其中M为Marker,1、2、3和4分别代表部分靶位点SG1敲除的植株。图4为OsKTN80b基因靶位点SG1敲除突变体的测序比对结果及测序峰图谱(其中一种突变方式)。图5为敲除植株包含靶位点SG2的PCR扩增测序的部分电泳图谱；其中M为Marker,1、2、3和4分别代表部分靶位点SG2敲除的植株。图6为OsKTN80b基因靶位点SG2敲除突变体的测序比对结果及测序峰图谱(其中一种突变方式)。图7为日本晴和OsKTN80b基因CRISPR/Cas9敲本文档来自技高网...
【技术保护点】
OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用；其特征在于所述的OsKTN80b基因由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
【技术特征摘要】
1.OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用；其特征在于所述的OsKTN80b基因由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成。2.用于敲除水稻OsKTN80b基因的靶点序列，其特征在于所述的靶点序列为SG1或SG2，或SG1和SG2的组合；其中所述的SG1由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列组成；所述的SG2由SEQIDNo.5所示的核苷酸序列组成；即SG1：5’-CAGAAGGAACTCATGGGGA-3’(SEQIDNo.4)；SG2：5’-TTGAATTGATTGGGTCTAC-3’(SEQIDNo.5)。3.权利要求2所述的靶点序列在降低...
【专利技术属性】
技术研发人员：钦鹏，胡彬华，李仕贵，张国华，陈微兰，涂斌，王玉平，马炳田，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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