家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种家蚕微孢子虫

DNA2 gene and its application in silkworm, Bombyx mori

The present invention discloses a kind of micro spore worm of silkworm

【技术实现步骤摘要】
家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种来源于家蚕微孢子虫的解旋酶和核酸酶DNA2基因(DNAreplicationATP-dependenthelicase/nucleaseDNA2-like)及其应用。
技术介绍
家蚕微孢子虫病是病原家蚕微孢子虫(Nosemabombycis，N.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病。家蚕微孢子虫是一类细胞内专性寄生的真核生物，之前一直属于原虫，近些年被划分到真菌类。因其具有垂直传播的特点使成为了家蚕病原微生物中最受人关注的一种，也因此成为家蚕病原微生物中唯一需要检疫的疫病。从19世纪发现到现在，家蚕微孢子虫病对各国的养蚕业造成巨大的损失。除此之外，其他不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。最初人们对家蚕微粒子病的检测主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行，但是显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，很难区分不同种属的微孢子虫及其类似物。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。现有技术中常用的靶基因SSUrRNA，研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原基因DNA的PCR有效扩增。专利技术人团队也先后发现了多种适用于家蚕微粒子病PCR检测的靶基因，具有较好的检测效果，各有优势和缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种家蚕微孢子虫DNA2基因。本专利技术另一目的是提供该基因在检测家蚕微孢子虫方面的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先获得了一个家蚕微孢子虫DNA2基因，其全长序列如SEQIDNO.1所示。其ORF框序列如SEQIDNO.2所示。所述家蚕微孢子虫DNA2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。同时，本专利技术设计了用于检测的DNA2基因的引物，并对一些其他桑园昆虫进行了了DNA2基因的特异性检测，结果显示，检测引物F/R对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，因此，如下所述应用均应在本专利技术的保护范围之内。家蚕微孢子虫DNA2基因在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用。一种特异性检测家蚕微孢子虫的检测引物F/R，上下游引物序列分别如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以权利要求6所述的检测引物F/R进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。其中，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系(20μL)为：SYBRGreenMix10μL，Forwrdprimer(10pmol/μL)0.5μL，Reverseprimer(10pmol/μL)0.5μL，cDNA2μL，ddH2O7μL。所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。另外，所述方法在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用，也在本专利技术的保护范围之内。不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。蚕桑生产环境较为复杂，混杂有其他种类的微孢子虫。本专利技术DNA2基因的发现对于治疗和检测的理论验证和生产实践均有一定的意义。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术克隆获得了一种家蚕微孢子虫DNA2基因，并以此为基础提供了一组特异性检测家蚕微孢子虫的特异性检测引物组，对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，在家蚕微孢子虫的特异性检测方面具有很好的应用前景。而且，家蚕微孢子虫DNA2基因作为一个新发现的蛋白基因，具有潜在的功能应用，为家蚕微孢子虫的相关研究提供了一个新的素材和基础。附图说明图1为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白氨基酸系统发育树(N-J)。注：Bootstrap＝1000,图中有下划线的是本研究测定的家蚕微孢子虫DNA2蛋白氨基酸序列。图2为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白多重比对；1.家蚕微孢子虫DNA2蛋白，2.蜜蜂微孢子虫BRL01蛋白，3.蜜蜂微孢子虫DNA解旋酶蛋白，4.兔脑炎原虫DNA复制解旋酶蛋白，5.兔脑炎原虫DNA解旋酶蛋白，6.兔脑炎原虫EcunIII-L蛋白，7.肠脑炎微孢子虫DNA解旋酶，8.线虫DNA复制解旋酶蛋白。图3为家蚕微孢子虫DNA2基因的PCR引物设计简图。图4中A、B、C分别为引物1F/R、2F/R、3F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。图5为检测引物F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。图6为检测引物F/R对家蚕微孢子虫的检测灵敏性；注：M:DL2000Marker；泳道：1.10-1ng/ulDNA；2.10-2ng/ulDNA；3.10-3ng/ulDNA；4.10-4ng/ulDNA；4.10-4ng/ulDNA；5.10-5ng/ulDNA；6.无菌水。图7为感病家蚕中肠中N.bDNA2基因的表达水平。图8为感病家蚕蚕卵中N.bDNA2基因的表达水平。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1DNA2基因克隆1、引物设计同源性分析预测：通过与其他种微孢子虫基因组基因进行同源性分析等手段，设计了家蚕微孢子虫DNA2基因序列编码区的扩增引物ORF-F/ORF-R：引物ORF-F(SEQIDNO.4所示)：5'ATTATCATATGAACAACAATAAGTC3'；引物ORF-R(SEQIDNO.5所示)：5'ATATGAAGCTTCATAAAATCTCTAAT3'。2、PCR扩增和克隆利用家蚕微孢子虫基因组DNA为模板，以引物ORF-F/ORF-R进行PCR扩增目的基因，将克隆的片段连接到PET28A载体上，然后送去公司(上海生工)进行测序，对测序结果进行验证分析后，获得家蚕微孢子虫DNA2基因全长序列如SEQIDNO.1所示，编码区序列如SEQIDNO.2所示。另外研究得出，家蚕微孢子虫DNA2基因所编码蛋白序列如SEQIDNO.3所示。3、序列同源性分本文档来自技高网...

【技术保护点】
家蚕微孢子虫

【技术特征摘要】
1.家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其全长序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其ORF框序列如SEQIDNO.2所示。3.家蚕微孢子虫DNA2基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.家蚕微孢子虫DNA2基因在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。5.家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用。6.一种特异性检测家蚕微孢子虫的引物组，其特征在于，为检测引物F/R，上下游引物序列分别如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。7.一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，李峙贤，孙勋勋，杨宏宇，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44