本发明专利技术公开了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)生殖标记基因vasa及其应用，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；还公开了河南华溪蟹基因vasa编码的蛋白序列，如序列表SEQ ID NO.2所示，以及该蛋白的理化特性，氨基酸残基的特征及蛋白结构和功能域的特征。所述基因编码区起始于5’端第142位核苷酸，终止于第2214位核苷酸，编码690个氨基酸残基。本发明专利技术河南华溪蟹的生殖标记基因，经鉴定其特异表达于河南华溪蟹的卵巢和精巢组织中，可用于河南华溪蟹及其相近物种生殖标记分子的开发和应用，对指导溪蟹的人工繁殖具有实际意义。
Henan reproductive marker gene vasa and its application
The present invention discloses Henan crab (Sinopotamon henanense) reproductive marker gene vasa and its application, the nucleotide sequence of the gene is shown in a sequence table SEQ ID NO.1; also discloses Henan Hua crab protein sequence of gene vasa encoding, such as SEQ ID NO.2 sequence list is shown, and the protein the physicochemical properties, characteristics and protein structure and functional domain of amino acid residues. The gene coding region starts at 5 'end 142nd nucleotides and terminates at 2214th nucleotides, encoding 690 amino acid residues. The reproductive marker gene of the invention of Henan henanense, identified the specific expression in Henan crab ovary and testis, development and application for Henan crab and its similar species reproductive marker, which has practical significance to guide the artificial breeding of freshwater crabs.
【技术实现步骤摘要】
河南华溪蟹生殖标记基因vasa及其应用
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)一种生殖标记基因，具体为生殖细胞特异表达基因vasa的全长cDNA克隆及其应用。
技术介绍
甲壳动物十足目(decapoda)短尾次目(brachyura)中的一个特殊分支—淡水蟹(freshwatercrabs)，终身生活在淡水环境中。溪蟹是野生水资源中广泛分布的淡水蟹类，其生殖发育方式与其它十足动物存在显著差异。溪蟹卵粒特别大，产卵量小，卵壳厚，胚胎直接发育，卵内变态。而大多数海蟹和洄游性绒螯蟹卵粒非常小，产卵量很大，卵壳薄，胚胎间接发育。然而，迄今为止，溪蟹的生殖发育调控方式尚不清楚，其人工繁殖一直无法掌控。主要原因是溪蟹的生殖规律仍属未知，如溪蟹卵子发生过程中的细胞学规律如何？生殖细胞是否发育良好，其质量如何？哪些重要分子在卵子发生中发挥关键作用？因此，在溪蟹中鉴定并开发生殖标记分子，成为解决相关问题的有效快捷手段。基因vasa所编码的蛋白为ATP-依赖的RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白。VASA蛋白具有非常保守的结构域：N端RGG(Arg-Gly-Gly)重复序列和解旋酶核心结构，包含DEAD-box的8个保守结构域，分别为DEXDc和HELICc结构域。解旋酶的核心结构不仅在RNA解旋中发挥关键作用，而且解旋酶活性本身为VASA蛋白在生殖质中定位所必须。基因vasa最早是在果蝇中被发现，在生殖细胞中特异表达。在模式生物中，vasa已被作为生殖标记分子广泛用于生殖细胞的迁移、分化和发生等研究。VASA蛋白的生物学功能也已在模式生物中得到证实。蛋白功能的研究表明，VASA蛋白作为参与生殖细胞中如转录、pre-mRNA剪切、RNA转运、翻译起始、核糖体生物发生等几乎所有RNA的代谢过程。研究表明，突变果蝇vasa基因导致生殖细胞分化异常、卵子发生缺陷，并引起雌性个体不育。突变小鼠vasa基因，导致卵巢不育，造成精子发生过程被阻断、精子缺失。甲壳动物中，如中华绒螯蟹(EriocheirSinensis)、拟穴青蟹(ScyllaParamamosain)、日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)和中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)等不同物种中分别克隆了生殖基因vasa。尽管，vasamRNA在这些物种中都特异存在于生殖细胞中，但是vasa基因和蛋白的序列与结构因物种不同而存在着明显差异。中华绒螯蟹中克隆了2369bp的vasa基因全长cDNA，包含DEAD-box蛋白家族的8个保守结构域和两个锌指结构(CCHC)和一个Q-结构域。利用RACE-PCR方法，在拟穴青蟹中克隆了2,851bp的vasa基因全长cDNA。目前，有关溪蟹的基因组数据非常缺乏，生殖分子的信息几乎未知，因此，对了解溪蟹的特殊生殖方式，指导溪蟹的生产繁殖及保护溪蟹的种质资源等理论、实践中带来诸多不便，亟待寻找并开发一种生殖标记，为溪蟹人工繁殖中确定生殖细胞的状态和发育质量提供便捷有效的检测手段。河南华溪蟹，属于甲壳纲，十足目，短尾次目，华溪蟹科，不仅是重要的资源动物，而且在水生态环境保护中，已被用作水环境污染监测的指示生物。虽然，课题组在河南华溪蟹中对部分vasa基因进行了分离，但是，所获得的序列仅为vasa的部分序列。涉及编码重要功能域的序列，以及决定vasa在不同细胞中的表达和定位的3’UTR序列仍未获得(李怡婷，河南华溪蟹生殖调控基因vasa的克隆和原核表达，2016，硕士论文，王兰，孙敏)。因此，到目前为止，在具有特殊生殖发育方式的溪蟹中，有关基因vasa的分离仍待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术目的是为探索溪蟹的特殊生殖和发育机制提供一种生殖细胞特异表达的标记分子-基因vasa及其在表达鉴定中的应用。本专利技术为溪蟹生殖细胞的鉴定和分期提供快捷准确的方法。本专利技术的另一目的是获得河南华溪蟹基因vasa的全长cDAN序列和完整的蛋白序列，进而鉴定其物种特有的结构特征，分析决定其在河南华溪蟹中表达定位的序列特征。本专利技术的目的可通过以下技术方案来实现：首先，依据已公布的甲壳动物中vasa基因和蛋白序列的保守结构域，设计引物，如序列表SEQIDNo.3和4所示，PCR克隆获得河南华溪蟹vasa的部分核苷酸序列。其次，选取河南华溪蟹早期性腺组织，制备SMARTcDNA，采用RACE-PCR方法，在获得的保守序列的基础上，设计基因特异引物，如序列表SEQIDNo.5-8所示，分别克隆河南华溪蟹vasa基因的5’端和3’端序列，连接、转化、测序、拼接获得vasa的cDNA全长，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。使用在线分析软件对获得的核苷酸序列进行分析预测，确定克隆得到的cDNA全长为基因vasa的全长。通过预测分析vasa编码的蛋白序列及其结构特征，确定其物种特异的蛋白结构。vasa编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。进一步设计特异引物，如序列表SEQIDNo.9-12所示，通过RT-PCR方法，检测vasa在河南华溪蟹不同组织中的表达情况，揭示并鉴定河南华溪蟹基因vasa仅在性腺组织中特异表达。本专利技术从河南华溪蟹卵巢或精巢组织的SMARTcDNA文库中克隆的vasacDNA全长，名称为河南华溪蟹基因vasa(S.henanensevasa,SHvasa)。所述SHvasa的cDNA序列为序列表SEQIDNO.1中所示的核苷酸序列。通过NCBI/GenBank数据库中BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)工具，BLASTn对核苷酸序列进行比对分析，确定获得的cDNA全长为河南华溪蟹基因vasa。进一步分析显示，基因SHvasa共有2929个碱基(basepairs，bp)组成；开放阅读框起始于5’端第142bp的起始密码子ATG，终止于第2214bp的终止密码子TAA，共包含2073bp；编码690个氨基酸残基；具有141bp的5’非翻译区和715bp的3’非翻译区。本专利技术所述VASA蛋白名称为河南华溪蟹VASA蛋白(S.henanenseVASA,SHVASA)，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。利用Expasy在线分析工具Protparam分析SHVASA蛋白的理化性质，结果表明，SHVASA蛋白由10394个原子组成，推测其分子式为C3292H5100N936O1041S25，分子量为75247.8KD；理论等电点为5.00，包含101个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)，76个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)；在其氨基酸组成中，甘氨酸比例最高，达到12.3％，天冬氨酸次之，占7.7％；SHVASA蛋白的半衰期为30h，属于稳定蛋白；亲水性等级为-0.480，为亲水蛋白。通过SignalP-4.1PredictionServer在线工具分析，结果表明，SHVASA蛋白不存在信号肽，是非分泌型蛋白。NetPhos2.0Server软件预测SHVASA蛋白的磷本文档来自技高网...
【技术保护点】
河南华溪蟹生殖标记基因vasa，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.河南华溪蟹生殖标记基因vasa，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的基因vasa，其所述核苷酸序列为与序列表SEQIDNo.1所示序列互补的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述的河南华溪蟹生殖标记基因vasa编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。4.权利要求1中所述基因vasa的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取河南华溪蟹卵巢或精巢组织总RNA，合成cDNA第一链；(2)设计引物，序列如SEQIDNO.3和4所示；PCR克隆河南华溪蟹vasa的部分保守序列；回收并纯化PCR产物，与...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙敏，王兰，杜晓琳，李怡婷，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14
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