检测细胞RAI2基因启动子区DNA甲基化状态的引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于检测细胞RAI2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。本试剂盒首次选用细胞RAI2基因作为目标基因，该基因是本发明专利技术人通过甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)技术证明在结直肠癌中启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。经在结肠癌组织中验证，利用本发明专利技术所述引物对及试剂盒检测结直肠癌细胞的特异性好，达到48.98％；灵敏度高，达到1‰，即1000个细胞中有1个癌细胞就能够被检测出。应用本发明专利技术试剂盒来检测细胞RAI2基因启动子区高甲基化状态可作为结直肠癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。

Primer pairs and kits for detection of DNA methylation status of RAI2 gene promoter region in cells

The present invention provides primer pairs and kits for detecting methylation status of cell RAI2 gene promoter region. The kit for the first time using cell RAI2 gene as the target gene, the gene is the inventor by methylation specific PCR (Methylation Specific PCR, MSP) technology that promoter hypermethylation of the gene in colorectal cancer, with the first. After verification in colon cancer, and kit for detecting colorectal cancer cells by using the primer of the invention has good specificity, high sensitivity, reached 48.98%; 1 per thousand, or 1000 cells in 1 of cancer cells can be detected. The application of the kit of the invention is to detect RAI2 gene promoter methylation can be used as colorectal cancer diagnosis, efficacy, prognosis, residual disease detection and other means, and has the advantages of simple operation, good stability, has clinical significance and promotion of far-reaching.

【技术实现步骤摘要】
检测细胞RAI2基因启动子区DNA甲基化状态的引物对及试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测细胞RAI2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是世界第三大常见肿瘤，是肿瘤所致死亡的第四大主因(HaggarF.A.,BousheyR.P.Colorectalcancerepidemiology:incidence,mortality,survival,andriskfactors.ClinicsinColonandRectalSurgery.2009；22(4):191–197)。结直肠癌也是中国常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率明显上升，由恶性肿瘤的第4位上升为第3位。其中以结肠癌增加为著，并且右侧结肠癌亦呈明显增长趋势。右侧结肠癌由于该部位解剖特点及肿瘤的生物学特性，确诊时患者病期多为晚期。结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，目前由于尚缺乏早期诊断和治疗的有效方法，病人预后常不良。因此针对结直肠癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。随着后基因组时代的到来，表观遗传学(Epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是指DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达变化的学科，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题，例如：单卵双生的姊妹具有完全相同的基因型，在不同的环境下长大后其性格特征及对疾病的易感性不同。在消化系统肿瘤中，表观遗传学研究主要集中在DNA甲基化上。基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点或判断预后手段。目前有许多检测甲基化的方法，如：一、亚硫酸氢钠法(SodiumBisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR，MSP)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuE)等；二、甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱(MSRF)、限制性标记基因组扫描技术(RLGS)、差异性甲基化杂交分析(DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。但多数方法缺乏稳定性和可靠性。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman专利技术了此项技术后，大大简化了DNA甲基化的检测方法，使得表观遗传学研究更加迅速的向前发展，其突出的优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制。目前MS-PCR已成为常规方法及金标准，尤其在临床标本检测方面已作为首选。MS-PCR的基本原理是：DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，因胸腺嘧啶和尿嘧啶互补，可用胸腺嘧啶替代尿嘧啶设计引物。针对基因启动子区特定位点分别设计甲基化引物及非甲基化引物，进行PCR扩增后，凝胶电泳显示结果，即可分辨出甲基化、非甲基化或部分甲基化。RAI2基因最初是在胚胎源性肿瘤中被发现受维甲酸(retinoicacid)诱导表达的7个基因之一(JonkLJ,deJongeME,VervaartJM,WissinkS,KruijerW.Isolationanddevelopmentalexpressionofretinoic-acid-inducedgenes.DevBiol.1994；161(2):604–614.)。WalpoleSM等人证实RAI2定位于X染色体短臂2区2带，即Xp22。并发现RAI2可表达长约2.5kb的RNA转录本，而其RNA水平的表达可在4种胚胎组织(包括脑、肺、肾和心脏)和8种成体组织(包括心脏、脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾脏、胰腺和视网膜)中检测到(WalpoleSM,HiriyanaKT,NicolaouA,BinghamEL,DurhamJ,VaudinM,RossMT,YatesJR,SievingPA,TrumpD.Identificationandcharacterizationofthehumanhomologue(RAI2)ofamouseretinoicacid-inducedgeneinXp22.Genomics.1999Feb1；55(3):275-283)。有文献报道RAI2的缺失或可导致楔形牙综合征，但尚存争议(WalpoleSM,RonceN,GraysonC,DessayB,YatesJR,TrumpD,ToutainA.ExclusionofRAI2asthecausativegeneforNance-Horansyndrome.HumGenet.1999May；104(5):410-411.；LiaoHM,NiuDM,ChenYJ,FangJS,ChenSJ,ChenCH.IdentificationofamicrodeletionatXp22.13inaTaiwanesefamilypresentingwithNance-Horansyndrome.JHumGenet.2011Jan；56(1):8-11.)。而RAI2与肿瘤及其他疾病的关系鲜有报道。最近一项研究发现RAI2在ER(Estrogenreceptor，雌激素受体)阳性的乳腺癌细胞中高表达，而在高侵袭性间叶细胞样细胞系中低表达，并进一步证实RAI2可通过抑制AKT信号通路抑制乳腺癌的侵袭和转移，RAI2可通过2个高度保守的结构域(称为ALDLS结构域)与CtBP(C-terminalbindingprotein-2)蛋白直接作用，调控下游基因如GRHL2、FOXOA1和GATA3等的表达，从而参与调控细胞分化、侵袭迁移等行为。而RAI2低表达的乳腺癌和结直肠癌患者预后较差(WernerS,BrorsB,EickJ,MarquesE,PogenbergV,ParretA,KemmingD,WoodAW,EdgrenH,NeubauerH,StreichertT,RiethdorfS,BediU,BaccelliI,JückerM,EilsR,FehmT,TrumppA,JohnsenSA,J,WilmannsM,MüllerV,PantelK,WikmanH.SuppressionofearlyhematogenousdisseminationofhumanbreastcancercellstobonemarrowbyretinoicAcid-induced2.CancerDiscov.2015May；5(5):506-519.)。本专利技术首次通过MSP的方法在结直肠癌中成功验证了细胞RAI2启动子区的高甲基化。预实验结果提示RAI2基因可能是结肠癌中的新的抑癌基因，此外RAI2基因的启动子区高甲基化状态可能是一个新的肿瘤分子标记物。本专利技术人应用MSP方法对大量结肠癌肿瘤组织标本以及正常的结肠组织标本进行检测，以明确RAI2基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对，其特征在于，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'‑GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC‑3'，下游引物核苷酸序列为：5'‑AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG‑3'；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'‑TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT‑3'，下游引物核苷酸序列为：5'‑AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3'；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3'。2.一种利用如权利要求1所述的引物对进行MS-PCR的方法，其特征在于：所述方法的反应条件如下：在95℃下预变性5min，接着进入循环，在95℃下变性30s，在60℃下退火30s，在72℃下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸7min。3.如权利要求1所述的引物对在制备用于诊断结肠癌或直肠癌疾病的检测产品...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭明洲，闫文姬，杨云生，戴广海，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11