一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用，具体地，本发明专利技术提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，所述引物对包括扩增PrP基因的特异性引物对：PrP‑F2(上游引物)：5’‑ACCCAGATTTTAACATAGAG‑3’(SEQ ID NO.1)；和PrP‑R2(下游引物)：5’‑TTTTACAGAAACCAAGGACC‑3’(SEQ ID NO.2)。本发明专利技术的鉴定方法简便易行，操作简便，可以对转hLZ基因羊杂交群体中的纯合子和杂合子转基因羊进行准确、快速和高通量筛选。

A rapid method for identification of homozygous transgenic sheep and its application

The invention provides a method for rapid identification of homozygous transgenic sheep and its application, specifically, the present invention provides a method for specific primers for the identification of homozygous transgenic sheep, the primers including PrP gene were amplified by specific primers of PrP F2: (upstream primer):5 'ACCCAGATTTTAACATAGAG 3 \(SEQ ID NO.1 PrP (R2); and downstream primer:5') TTTTACAGAAACCAAGGACC 3\ (SEQ ID NO.2). The identification method of this invention is simple and easy to operate, and can be used for accurate, rapid and high-throughput screening of homozygous and heterozygous transgenic sheep of transgenic hLZ sheep hybrid population.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用
本专利技术涉及转基因动物遗传育种领域，具体地，涉及一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用。
技术介绍
转基因技术是现代农业中重要的遗传育种技术之一，在转基因动物的研究中，若外源基因随机插入动物基因组中，插入拷贝数和位点都不确定，在进行转基因后代育种时，后代会出现基因分离现象，从而导致转基因遗传不稳定或表达不稳定的现象。转基因动物自交群体由杂合子转基因动物、纯合子转基因动物、同胞非转基因动物组成，只有纯合子转基因的动物才能稳定遗传，而不会出现性状分离现象，也只有纯合子的转基因动物才能作为侯选的优良育种材料。因此，如何快速、准确地鉴定和筛选出纯合子转基因羊是转基因羊育种的关键之一。传统的转基因动物纯合子鉴定方法常为Southern杂交法，Southern杂交法是分子生物学的经典实验方法，CGH、FISH等方法也常用于转基因拷贝数及纯合子的分析(LarramendyMLetal,1998；KallioniemiAetal,1996；ArmourJAetal,2000)。但上述方法存在一定缺陷，工作量大、周期长、步骤繁多、费时费力。Southern方法在基因组酶切消化不彻底的情况下会对插入基因拷贝数产生误判，同时在该实验过程中涉及放射性同位素等具有潜在危险性的药品，对发生重排的外源基因检测的精度不够等(WengHBetal,2004)。近年来，利用实时荧光定量PCR的方法来进行外源基因定量检测的方法迅速发展起来，而实时荧光定量PCR的检测结果和Southern杂交法的检测结果接近(InghamDJetal，2001；SongPetal,2002)操作更简单易行。实时荧光定量PCR在实际应用中该方法主要体现在两种方式上:一种是利用已知外源基因拷贝数的基因组作为标准品,通过建立标准曲线来进行绝对定量；另一种则是以基因组上已知拷贝数的内源基因作为内参,通过相对定量法来确定外源基因的拷贝数。在应用绝对定量法来检测转基因拷贝数时，基因组DNA与标准品的绝对定量的误差等可能会导致实验结果的不稳定与较大的误差。而目前的相对定量法在构建质粒标准品时多为将内参基因与目的基因分别构建阳性质粒，这种方法造成阳性质粒中基因的拷贝数无法精确定量，导致标准曲线的误差，造成实验结果不准确并大大增加了工作量。因此，本领域迫切需要开发一种能够克服上述已有技术缺陷，并且能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。本专利技术的另一目的是在于提供了一种纯合子转基因羊在转基因羊纯系建立和转基因羊新品种培育中的应用。本专利技术的第一方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，所述引物对包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：上游引物PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；下游引物PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)。在另一优选例中，所述PrP基因为内参基因。在另一优选例中，所述的第一引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。在另一优选例中，所述的第一引物对的下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。在另一优选例中，所述引物对还包括扩增hLZ(人溶菌酶)基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：上游引物hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQIDNO.:3)；下游引物hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQIDNO.:4)。在另一优选例中，所述的第二引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。在另一优选例中，所述的第二引物对下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。在另一优选例中，所述第一引物对和所述第二引物对带有可检测标记。本专利技术第二方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对组合，包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：(i)PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)；和扩增hLZ基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：(ii)hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQIDNO.:3)；hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQIDNO.:4)。本专利技术第三方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第一引物对，所述引物对包括扩增PrP基因的特异性引物对：PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；和PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)；以及使用说明书。在另一优选例中，所述试剂盒还包括(b)第二容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第二引物对，所述引物对包括扩增hLZ基因的特异性引物对：hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQIDNO.:3)；和hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQIDNO.:4)。在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、和蒸馏水。在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，A盒为标本处理单元，包括所述DNA抽提试剂盒；B盒为核酸扩增检测单元，包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、蒸馏水等。在另一优选例中，所述试剂盒还含有任选的PCR检测相关试剂，如PremixExTaq、ROXreferenceDyeⅡ、蒸馏水。在另一优选例中，所述的PCR检测相关试剂为PremixExTaq。本专利技术第四方面提供了一种本专利技术第一方面所述引物对或本专利技术第二方面所述引物对组合的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于(i)鉴定和筛选纯合子的转基因羊；和/或(ii)检测hLZ基因在纯合子转基因羊基因组中的拷贝数。在另一优选例中，所述检测为实时定量PCR双标准曲线法检测。本专利技术第五方面提供了一种鉴定纯合子转基因羊的方法，包括步骤：(a)提供一待测样本，所述待测样本含有转基因羊的基因组DNA；(b)在第一反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第一引物对扩增所述待测样本中的内参基因，获得第一扩增产物；并在第二反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第二引物对扩增所述待测样本中的外源目的基因，获得第二扩增产物；(c)比较所述外源目的基因的第二扩增产物和所述内参基因的第一扩增产物的数值，从而判断所述待测样本是否为纯合子的转基因羊。在另一优选例中，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：上游引物PrP-F2：5’-AC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：上游引物PrP‑F2：5’‑ACCCAGATTTTAACATAGAG‑3’(SEQ ID NO.:1)；下游引物PrP‑R2：5’‑TTTTACAGAAACCAAGGACC‑3’(SEQ ID NO.:2)。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：上游引物PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；下游引物PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)。2.如权利要求1所述的特异性引物对，其特征在于，所述引物对还包括扩增hLZ(人溶菌酶)基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：上游引物hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQIDNO.:3)；下游引物hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQIDNO.:4)。3.一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对组合，其特征在于，包括扩增PrP基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：(i)PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)；和扩增hLZ基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：(ii)hLZ-F2：5’-AGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGT-3’(SEQIDNO.:3)；hLZ-R2：5’-TCATCCCTTCACTCATTCATTC-3’(SEQIDNO.:4)。4.一种用于鉴定纯合子转基因羊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第一引物对，所述引物对包括扩增PrP基因的特异性引物对：PrP-F2：5’-ACCCAGATTTTAACATAGAG-3’(SEQIDNO.:1)；和PrP-R2：5’-TTTTACAGAAACCAAGGACC-3’(SEQIDNO.:2)；以及使用说明书。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括(b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，俞慧清，陈建泉，陆平，
申请(专利权)人：上海杰隆生物工程股份有限公司，上海转基因研究中心，
类型：发明
国别省市：上海,31