包含黏琼脂芽孢杆菌菊粉蔗糖酶(INUO)的使用的组合物和方法技术

黏琼脂芽孢杆菌菌株WDG185表达一种菊粉蔗糖酶，该菊粉蔗糖酶有效合成广泛范围的具有GF3‑GF30的GF范围的IOS。提供了分离的和/或纯化的菊粉蔗糖酶、其重组工程化变体、其活性片段；编码该菊粉蔗糖酶的合成核酸、其变体、或其活性片段；包含该合成核酸的宿主细胞；以及包含该菊粉蔗糖酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造菊粉低聚糖。

Compositions and methods for the use of Bacillus cereus inulinase (INUO) containing sticky agar

Clay agar Bacillus strain WDG185 expressing an inulosucrase inulosucrase, the efficient synthesis of a wide range of GF3 GF30 GF range IOS. Provided are isolated and / or purified inulosucrase, the recombinant engineered variant, its active fragment; synthesis of nucleic acids, encoding the inulin of sucrase and its variants, or an active fragment containing the nucleic acid synthesis; host cell; and a composition comprising the inulin sucrase. Methods of using these compositions include the manufacture of inulin oligosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含黏琼脂芽孢杆菌菊粉蔗糖酶(INUO)的使用的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2014年12月05日提交的美国临时申请USSN62/088,320的优先权权益，将其以其全文通过引用结合在此。
提供了从黏琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradhearens)分离的和/或纯化的菊粉蔗糖酶(inulosucrase)、其重组工程化变体、其活性片段；编码该菊粉蔗糖酶的合成核酸及其变体；包含该合成核酸的宿主细胞；以及包含该菊粉蔗糖酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造菊粉低聚糖(inulooligosaccharide)。序列表附加了包含SEQIDNO:1-19的序列表，并且将该序列表以其全文通过引用结合在此。专利技术背景菊粉型低聚果糖(FOS)，即菊粉低聚糖(IOS)，由于其有益的健康影响而受到越来越多的关注。菊粉型短链FOS和菊粉型果聚糖由于其显示出明显的体外益生元效应，即作为有益细菌的食物来源而引人关注。菊粉还在食品工业中用作脂肪代用品，并且用于在若干种产品中提供质地和稳定性，这些产品是如甜点、面包、和发酵乳制品、以及婴儿配方食品。IOS包括由在果糖单元之间具有β-(2→1)键的果糖基单元链延伸的蔗糖分子。IOS聚合物包含具有通用结构的重复单元GFn，其中“G”是指葡萄糖分子，并且“Fn”是指果糖单位数量。实例包括1-蔗果三糖(GF2)、1-蔗果四糖(GF3)和1F-蔗果五糖(GF4)。例如，来自植物的IOS聚合物通常包含30-50个果糖基单元。由植物、真菌、和细菌产生的果糖基转移酶(FT酶)促进FOS的合成。FT酶属于GH-J酶族，其包含糖苷水解酶32(GH32)和糖苷水解酶68(GH68)家族。目前已知在GH32和GH68家族内约有九十一个FT酶蛋白氨基酸序列。GH32和GH68家族共享五叶β-螺旋桨折叠，每个折叠由四个反平行的β-链组成，共同形成中心带负电荷的腔。将这些序列分为五个植物进化枝、一个真菌进化枝、和一个细菌进化枝。参见Alméciga-Díazetal.(2011)"Computationalanalysisofthefructosyltransferaseenzymesinplants,fungiandbacteria."Gene484:26-34[Alméciga-Díaz等人，(2011)，植物、真菌和细菌中的果糖基转移酶的计算分析，基因484:26-34]。GH68家族的FT酶将其底物蔗糖的果糖部分聚合成果聚糖。FT酶包含菊粉蔗糖酶和果聚糖蔗糖酶。通常，菊粉蔗糖酶通过β-(2→1)键催化聚合，并且果聚糖蔗糖酶催化β-(2→6)键的聚合。菊粉蔗糖酶催化化学反应，该化学反应导致通过β-(2→1)键进一步聚合并且导致葡萄糖的生成：相对低数量的已知的FT酶已被鉴定为菊粉蔗糖酶(EC2.4.1.9)。目前已鉴定的菊粉蔗糖酶和编码基因主要存在于乳酸菌中：格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)菌株、变异链球菌(Streptococcusmutans)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)CW28、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)NCC533、罗伊氏乳杆菌(L.Reuteri)121、和罗伊氏乳杆菌TMW1.106。来自GH68家族的所表征的菊粉蔗糖酶和基因合成大的菊粉聚合物。例如，罗伊氏乳杆菌121INU菊粉蔗糖酶合成大小在1×107Da以上的菊粉聚合物；约氏乳杆菌INUJ菊粉蔗糖酶合成大小约4×107Da的菊粉聚合物；并且变异链球菌GS-5菊粉蔗糖酶合成大小约7×107Da的菊粉聚合物。虽然由这些酶合成的菊粉聚合物较大，但是菊粉低聚糖具有GF2-GF6的较小GF范围。来自芽孢杆菌物种217C-11的果聚糖蔗糖酶(fructansucrase)已由生物化学表征。该芽孢杆菌酶只能合成具有GF10-GF25的GF范围以及在GF16-GF17处的峰的IOS。参见Wadaetal.(2003)“AnovelenzymeofBacillussp.217C-11thatproducesinulinfromsucrose.”Biosci.Biotechnol.Biochem.67:1327-1334[Wada等人(2003)，从蔗糖生产菊粉的芽孢杆菌属217C-11的新颖酶，生物科学、生物技术和生物化学，67:1327-1334]。概述黏琼脂芽孢杆菌菌株WDG185表达一种菊粉蔗糖酶，该菊粉蔗糖酶有效合成广泛范围的具有GF3-GF30的GF范围的IOS。提供了分离的和/或纯化的菊粉蔗糖酶、其重组工程化变体、其活性片段、编码该菊粉蔗糖酶的合成核酸、其变体、或其活性片段、包含该合成核酸的宿主细胞、以及包含该菊粉蔗糖酶的组合物。使用这些组合物的方法包括制造菊粉低聚糖。因此，提供了一种来自黏琼脂芽孢杆菌的、分离的、重组表达的菊粉蔗糖酶(INUO)，其重组工程化变体，或其活性片段，该菊粉蔗糖酶包含由SEQIDNO:4的氨基酸32-453组成的多肽，其中该变体能够催化包含β-(2→1)键的菊粉低聚糖的聚合，并且其中该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少60％序列同一性。包含由SEQIDNO:4的氨基酸32-453组成的多肽的菊粉蔗糖酶可以包含通常不与来自黏琼脂芽孢杆菌菌株WDG185的天然存在的INUO(SEQIDNO:4)缔合的至少一个氨基酸。重组工程化变体可以与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性。可替代地，重组工程化变体可以与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少99％或至少99.5％序列同一性。与SEQIDNO:4的氨基酸32-453不同一的重组工程化变体的氨基酸残基可以选自来自C-或N-末端的保守性氨基酸取代或缺失。重组工程化变体的氨基酸序列可以包含与SEQIDNO:4的氨基酸79-393同一的序列。还提供了包含菊粉蔗糖酶的组合物。菊粉蔗糖酶可以处于冷冻干燥的粉末形式、包入胶囊内的形式、包衣形式、颗粒形式、或液体配制品。该组合物可以进一步包含稀释剂。还提供了(1)编码菊粉蔗糖酶的合成核酸；(2)包含该合成核酸的载体；和(3)包含该合成核酸或该载体的宿主细胞。该载体可以是表达载体。载体可以包含由SEQIDNO:3的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一个实施例中，该宿主细胞可以包含由SEQIDNO:3的核苷酸序列组成的多核苷酸。在另一个实施例中，一种非黏琼脂芽孢杆菌的宿主细胞可以包含SEQIDNO:3的核苷酸序列。进一步提供了组合物，包含宿主细胞和食品级、饲料级、工业级、或药理学上可接受的运载体、稀释剂、或赋形剂。使用组合物的方法可以包括将组合物给予至个体，其中该组合物能够充当个体中的益生菌。还提供了一种生产菊粉低聚糖(IOS)产物的方法，该方法包括将菊粉蔗糖酶与果糖源接触，并使该果菊粉蔗糖酶与该果糖源在pH5-10并且在40℃-60℃反应以产生IOS产物。果糖源可以是蔗糖、水苏糖、棉子糖、菊粉、或低聚果糖(FOS)。IOS产物可能具有GF3-GF100、GF3-GF30、或GF10-GF25本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自黏琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhearens)的、分离的、重组表达的菊粉蔗糖酶(INUO)，其重组工程化变体，或其活性片段，该菊粉蔗糖酶包含由SEQ ID NO:4的氨基酸32‑453组成的多肽，其中该变体能够催化包含β‑(2→1)键的菊粉低聚糖的聚合，并且其中该变体与SEQ ID NO:4的氨基酸序列的氨基酸32‑453具有至少60％序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.05 US 62/088,3201.一种来自黏琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradhearens)的、分离的、重组表达的菊粉蔗糖酶(INUO)，其重组工程化变体，或其活性片段，该菊粉蔗糖酶包含由SEQIDNO:4的氨基酸32-453组成的多肽，其中该变体能够催化包含β-(2→1)键的菊粉低聚糖的聚合，并且其中该变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少60％序列同一性。2.如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶，其中包含由SEQIDNO:4的氨基酸32-453组成的多肽的多肽包含通常不与来自黏琼脂芽孢杆菌菌株WDG185的天然存在的INUO(SEQIDNO:4)缔合的至少一个氨基酸。3.如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶，其中该重组工程化变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性。4.如权利要求3所述的菊粉蔗糖酶，其中该重组工程化变体与SEQIDNO:4的氨基酸序列的氨基酸32-453具有至少99％或至少99.5％序列同一性。5.如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶，其中与SEQIDNO:4的氨基酸32-453不同一的重组工程化变体的氨基酸残基选自来自C-或N-末端的保守性氨基酸取代或缺失。6.如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶，其中该重组工程化变体的氨基酸序列包含与SEQIDNO:4的氨基酸79-393同一的序列。7.一种包含如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶的组合物。8.如权利要求7所述的组合物，其中该菊粉蔗糖酶处于冷冻干燥的粉末形式、包入胶囊内的形式、包衣形式、颗粒形式、或液体配制品。9.如权利要求7所述的组合物，进一步包含稀释剂。10.一种编码如权利要求1所述的菊粉蔗糖酶的合成核酸。11.一种包含如权利要求10所述的合成核酸的载体。12.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·克拉利，M·科尔克曼，C·莱夫朗，J·G·德诺贝尔，A·霍克斯特拉，V·阿尔坎，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US