新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术基于穿心莲高通量测序的相关结果，用反向遗传学的方法找到并鉴定新穿心莲内酯合成的最后一步关键酶ApUGT73AU1，填补新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯苷生物合成途径的终端空白，为进一步生物合成新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。

New andrographolide glycosyl transferase protein and its coding gene and Application

The invention discloses a new andrographolide glycosyl transferase protein and its coding gene and application. Neoandrographolide sugar provided by the invention is as follows: a transferase protein) or b) protein: a) amino acid sequence by the sequence 2 in the sequence table shown in protein; b) amino acid sequence of sequence 2 in the sequence list shown by one or several amino acid residues and substitution deletion and / or added and has catalytic activity of Andrographolide by a derived protein). The present invention results Andrographis high-throughput sequencing based method for reverse genetics found and identified the last key enzyme ApUGT73AU1 neoandrographolide synthesis, fill the blank of the terminal of andrographolide and dehydroandrographolide biosynthetic process, as a new synthesis of andrographolide and dehydroandrographolide glycosides provides glycosyltransferases the enzyme protein and its encoding sequence.

【技术实现步骤摘要】
新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
穿心莲是应用广泛的重要药用植物，其提取物具有清热解毒、消炎、消肿止痛作用。其主效成分——穿心莲内酯已被制作为多种非处方药，而另一种主效成分——新穿心莲内酯单体还未成药，因此新穿心莲内酯的生物合成途径的研究将具有重要的医学意义和经济价值。穿心莲属于爵床科，该属约包括20种，其中药用的主要是穿心莲(Andrographispaniculata(Bm.F)Nees)，它被认为是苦味之王，被中国、印度、泰国和马来西亚等国家广泛应用。穿心莲提取物在治疗咽喉炎、流感和上呼吸道感染效果良好，并且还对疟疾和HIV具有治疗作用。现在中国食品药品监督管理局(SFDA)批准的穿心莲药品，常见的有穿王消炎胶囊、穿心莲内酯软胶囊和穿心莲内酯滴丸，主要利用的为穿心莲内酯(andrographolide)。新穿心莲内酯(neoandrographolide)与穿心莲内酯同为穿心莲的主效成分，它们具有同样的二萜骨架结构，但是新穿心莲内酯比穿心莲内酯多了一个葡萄糖基，少了两个羟基(图1)。新穿心莲内酯结构上的特征使得它可能具有穿心莲内酯相似或不同的药理作用。同穿心莲内酯药理作用相似，体内外实验表明新穿心莲内酯在抗炎、抗肿瘤、降血压、治疗冠心病等方面具有显著作用。陈咏梅还发现新穿心莲内酯在治疗肺部肿瘤方面更有效果；新穿心莲内酯可能在治疗老年性痴呆(Alzhemier氏病)起到重要作用，穿心莲内酯药理研究中还未有此方面的报到。因此，新穿心莲内酯成为穿心莲类新药的研究热点，对其生物合成途径的研究将具有重要的研究意义和潜在的巨大经济价值。新穿心莲内酯糖基转移酶催化了其合成途径的最后一步反应，此酶的鉴定将为新穿心莲内酯生物合成途径的整体解析起到极大的促进作用，并为其生物合成提供理论基础。虽然穿心莲内酯的骨架二萜结构——ent-柯巴基焦磷酸(ent-CPP)的合酶已经被鉴定，但是下游途径都是未知的，包括可能的去磷酸化酶、P450酶和糖基转移酶。这使得生物合成新穿心莲内酯或者穿心莲内酯几乎不能实现。值得一提的是，糖基转移酶负责代谢终端产物的糖基化修饰，且其催化反应的底物和产物清晰，它的鉴定将为整个途径的解析起到重要指引作用。对新穿心莲内酯糖基转移酶的鉴定，将为生物合成新穿心莲内酯提供酶学基础，并为解析新穿心莲内酯合成途径起到铺垫作用。新穿心莲内酯的生物合成将为其新药创制提供充足的原料保障，并为其它药用植物研究提供借鉴。目前人们已通过合成生物学实现了多种药用植物主要成分的生物合成。Paddon等在酵母里合成高含量的青蒿酸(25g/L)，这为发展中国家的疟疾患者用上廉价的青蒿素提供了可能。人参皂苷苷元和稀有人参皂苷CompoundK也已实现了生物合成，其中CompoundK还被SFDA批准了进行实验。甘草次酸和甘草酸糖基转移酶的鉴定，为生物合成甘草次酸和甘草酸提供了理论基础。同理，新穿心莲内酯糖基转移酶的鉴定也将极大地推进新穿心莲内酯的生物合成，为其成为新药提供充足的原料，同时，这也将为其它药用植物的研究提供思路。
技术实现思路
为了弥补以上领域的不足，本专利技术提供了新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。本专利技术所提供的新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白，名称为ApUGT73AU1，来源于穿心莲(Andrographispaniculata(Bm.F)Nees)。本专利技术的一个目的是提供一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。该编码基因含有1470个核苷酸，编码489个氨基酸的蛋白。将该基因命名为ApUGT73AU1，将其编码的蛋白命名为ApUGT73AU1。含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。所述蛋白在作为新穿心莲内酯糖基转移酶中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述的蛋白、所述编码基因在催化新穿心莲内酯苷元生成新穿心莲内酯中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术基于穿心莲高通量测序的相关结果，用反向遗传学的方法找到并鉴定新穿心莲内酯合成的最后一步关键酶ApUGT73AU1，填补新穿心莲内酯生物合成途径的终端空白，为进一步生物合成新穿心莲内酯提供了新穿心莲内酯糖基转移酶蛋白及其编码序列。附图说明图1为新穿心莲内酯和穿心莲内酯分子结构式；其中neoandrographolide为新穿心莲内酯；andrographolide为穿心莲内酯；Gly为葡萄糖基。图2为ApUGT73AU1基因克隆和载体构建，其中泳道3号为ApUGT73AU1。图3为ApUGT73AU1氨基酸比对图；红线标注的为PSPGbox；Sr：Steviarebaudiana；AY345974(SrUGT76G1)，AY345982(SrUGT74G1)，AY345978(SrUGT85C2)。图4ApUGT73AU1重组蛋白SDS-Page胶图，泳道3号为ApUGT73AU1。图5为重组蛋白ApUGT73AU1对脱水穿心莲内酯体外酶活分析UPLC图；Nap-A表示新穿心莲内酯苷元；Nap表示新穿心莲内酯。图6重组蛋白ApUGT73AU1对脱水穿心莲内酯体外酶活分析UPLC图；Dp-A，脱水穿心莲内酯；Dp-G，脱水穿心莲内酯苷。图7为ApUGT73AU1对新穿心莲内酯苷元催化产物MS鉴定图；Nap-A表示新穿心莲内酯苷元；Nap表示新穿心莲内酯。图8为Q-TOF-MS鉴定重组蛋白ApUGT73AU1对脱水穿心莲内酯的催化产物；Dp-A，脱水穿心莲内酯；Dp-G，脱水穿心莲内酯苷。图9为ApUGT73AU1重组蛋白酶催化活性。具体实施方式实施例1、克隆新穿心莲内酯糖基转移酶的编码基因一、基因克隆的方法和步骤收集3月大的穿心莲(Andrographispaniculata(Bm.F)Nees)(记载过该材料的非专利文献是：李俊仁,陈秀珍,刘凯频,等.穿心莲连作土壤提取物对其种子的化感作用[J].广州中医药大学学报,2016,33(3):389-395.)植物茎和叶，分析其中的穿心莲内酯类含量，发现叶中富含大量的穿心莲内酯、穿心莲内酯苷、脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯苷和微量的新穿心莲内酯。因此，利用上面材料，借助illumina平台进行RNAseq。穿心莲中组织表达谱RNAseq数据表明，获得31个高表达的ApUGT73AU1序列，基于转录组数据，结合ApUGT73AU1保守结构域PSPGbox，得到31个300aa-500aa的Ap本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对新穿心莲内酯具有催化活性的由a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈士林，尹青岗，孙伟，曾君南，韩小燕，黄铭坤，宋驰，冷梁，师玉华，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，江西青峰药业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11