本发明专利技术提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其制备方法。所述酰基转移酶为SEQID NO：2所示的氨基酸序列在161位，163位，180位，235位进行的突变的突变体；该新型酰基转移酶酶活为野生型酶的12倍，本发明专利技术构建的酰基转移酶具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。
A acyltransferase and its mutants for catalytic synthesis of Simvastatin
The present invention provides a catalytic synthesis of simvastatin acyltransferase and its preparation method. The amino acid sequence of SEQID NO:2 acyltransferase is shown in 161, 163, 180, 235 of the mutant; the new acyltransferase activity was 12 times that of the wild type enzyme, constructed by the invention has low cost characteristics of acyltransferase enzyme, transformation time of short process, simple operation, wide with the large-scale industrial application prospect.
【技术实现步骤摘要】
一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其突变体
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，涉及一种用于催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其突变体。
技术介绍
辛伐他汀，商品名为舒降之（Zocor），英文名为Simvastatin，辛伐他汀是他汀类（statin）的降血脂药物，为羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，为血脂调节剂。文献资料表明，有降低高脂血症家兔血清、肝脏、主动脉中总胆固醇（TC的含量，）降低极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的作用。临床用于治疗高胆固醇血症、冠心病，控制血液中蛋白醇的含量以及预防血管疾病。辛伐他汀由美国默克公司开发，该品于1988年首次上市，1991年12月获美国FDA批准。2000年美国默克的舒降之（Zocor）在全球销售榜上排在第二名，销售额为52.8亿美元，2001年达到66.7亿美元的巅峰，2002年为55.8亿美元，具有巨大的市场需求。目前工业界生产辛伐他汀的方法主要为化学合成法，发酵法和生产转化法，主要中间体可以通过发酵获得红麴素J（又称红曲素、MonacolinJ，CAS号：132748-10-8）。化学合成法，由中间体红麴素J（又称红曲素、MonacolinJ）出发，通过化学催化的保护、脱保护、水解、酯化等一系列反应获得辛伐他汀，显而易见的是，该类方法受限于步骤繁多，试剂种类多消耗大，产品分离复杂等缺陷，并非生产辛伐他汀的最佳方法。发酵法主要采用构建的基因工程改造的土曲霉菌株，采用发酵法生产辛伐他汀，但辛伐他汀的产量与传统的发酵方法比较并没有表现出明显的效果。生物转化法，目前利用已有的商品化酯酶催化的反应区域选择性较低，仍然会造成反应的产物的纯化步骤复杂等问题。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术的第一个目的在于提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶。本专利技术第二个目的是提供一种编码所述催化合成辛伐他汀的酰基转移本科的核苷酸序列。本专利技术第三个目的是提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体。本专利技术第四个目的是提供一种编码所述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体的核苷酸序列。本专利技术第五个目的是提供一种制备催化合成辛伐他汀的酰基转移酶突变体的方法。本专利技术第六个目的是提供采用酰基转移酶催化合成辛伐他汀的方法。本专利技术的技术解决方案如下：一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，所述酰基转移酶为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。一种如上述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。一种如上述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，该突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；与氨基酸序列SEQIDNO.2相比，在所述氨基酸序列SEQIDNO：4中携带D161N、Y163F、G180S、A235S四个突变体；其中，D161N代表第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成天冬酰胺，Y163F代表第163位氨基酸残基从酪氨酸变成苯丙氨酸，G180S代表第180位氨基酸残基从甘氨酸变成丝氨酸，A235S代表第235位氨基酸残基从丙氨酸变成丝氨酸。根据上述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一种制备上述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶突变体的方法，包括如下步骤：（1）首先构建酰基转移酶的基因工程菌株，将全基因合成的SEQIDNO：1核苷酸序列的生物酶基因片段克隆到高效表达载体中pET29a（+），构建酰基转移酶的基因工程菌株，将该酰基转移酶经酶切重组到表达载体pET29a（+），转化到宿主细胞BL21（DE3）中；（2）将阳性克隆挑入LB液体培养基中活化后转入LB液体培养基中，培养，最后经发酵培养，收集菌体细胞；（3）破碎菌体细胞，得到所述的酰基转移酶。作为优选，所述的酶切重组为以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库，该引物核苷酸序列如下：F1:5'-GGAATTCCATATGCAGGATATCGAAC-3'；R1：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTTGCGCAGT-3'，该引物两端分别带有NdeI和HindIII限制性酶切位点。一种采用上述酰基转移酶制备辛伐他汀的方法：步骤包括：（1）合成辛伐他汀侧链：向反应釜中加入3-巯基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制备的酰基转移酶；开启搅拌，降温至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀侧链；（2）酰基转移酶催化合成反应：向反应釜中加入莫那克林酸、上述步骤中所述的辛伐他汀侧链、酸性溶液，控制反应体系pH值在9.0～10.0；加入上述的酰基转移酶，温度控制在25～45℃，搅拌反应48～60h；将反应液过滤；过滤完毕，温度控制在30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥，得中间体；（3）辛伐他汀粗品制备：将上述步骤制得的中间体加入二氯甲烷中溶解；温度控制在0～25℃下，往滤液中滴加入二氯甲烷与甲烷磺酸混合溶液；滴加完毕，温度控制在0～25℃搅拌1～4h；反应完毕，将反应液温度调至25～45℃，减压浓缩至固体，得到辛伐他汀粗品。作为优选，所述酸性溶液为盐酸、硫酸、醋酸中的一种。有益的效果：本专利技术采用新型酰基转移酶的生物酶活为野生型酶的12倍，合成转化率达到75%。该酰基转移酶热稳定性和贮存稳定性更好，活性高，将该酶应用于生产辛伐他汀，而且反应环境友好，生产成本低，转化时间短、工艺操作简单，反应体系杂质含量低，提高产率，易后处理，具有大规模工业应用的广泛前景。具体实施方法实施例1酰基转移酶的筛选以已报道的酰基转移酶LovD（来源于A.terreus）为模板，在NCBI上进行BLAST比对，从中选择相似性在40-70%之间的序列来进行基因合成和诱导表达，并用于辛伐他汀的酶法筛选。筛选体系如下：反应体系（底物浓度1g/L）成功筛选到一个可用于辛伐他汀酶法合成的酶，该酶为来源于fungalsp.NO.14919的某一未知蛋白，其编码核苷酸序列如SEQNO：2所示，编码的氨基酸序列如SEQNO：1所示。然而该酶的反应活性较低，需要进行定向进化来满足工业化应用需求。实施例2、突变体库的建立以全基因合成的表达质粒（由常州基宇生物技术有限公司合成，质粒上克隆有编码SEQIDNO：1所示的氨基酸序列、SEQIDNO：2所示的核苷酸序列）为模板，以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库。引物序列如下：F1:5'-GGAATTCCATATGCAGGATATCGAAC-3'；R1：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTTGCGCAGT-3'，两端分别带有NdeI和HindIII限制性酶切位点。易错PCR反应体系如下：10*PCRbuffer2.5μL，10mMdGTP0.5μL，10mMdTTP0.5μL，10mMdCTP2.5μL，10mMdATP2.5μL，1mMMnCl22.5μL，55mMMgCl22.5μL，10μMF11μL，10μMR11μL，Template（10ng/μL）1μL，TaqDNApolymerase（5U/μL，takara）0.2μL，ddH2O补至25μL。易错PCR在Bio-RadT100thermalcycler上进行，PCR程序如下：9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，所述酰基转移酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，所述酰基转移酶为SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.一种如权利要求1所述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。3.一种如权利要求1所述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，其特征在于：该突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；与氨基酸序列SEQIDNO.2相比，在所述氨基酸序列SEQIDNO：4中携带D161N、Y163F、G180S、A235S四个突变体；其中，D161N代表第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成天冬酰胺，Y163F代表第163位氨基酸残基从酪氨酸变成苯丙氨酸，G180S代表第180位氨基酸残基从甘氨酸变成丝氨酸，A235S代表第235位氨基酸残基从丙氨酸变成丝氨酸。4.根据权利要求4所述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。5.一种制备权利要求3所述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶突变体的方法，包括如下步骤：（1）首先构建酰基转移酶的基因工程菌株，将全基因合成的SEQIDNO：1核苷酸序列的生物酶基因片段克隆到高效表达载体中pET29a（+），构建酰基转移酶的基因工程菌株，将该酰基转移酶经酶切重组到表达载体pET29a（+），转化到宿主细胞BL21（DE3）中；（2）将阳性克隆挑入LB液体培养基中活化后转入LB液体培养基中培养，最后经发酵培养，收集菌体细胞；（3）破碎菌体细胞，得到所述的酰基转移酶。6.一种如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，黄科学，吴锋，余玉奎，巫佳，张晨晨，刘双喜，邢小飞，徐飞，
申请(专利权)人：江苏诚信药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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