一种用DSC作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法。所述制备方法中细菌多糖与蛋白共价结合前，细菌多糖首先与N,N’‑二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在pH为8.0‑9.5碱性水溶液条件下进行活化反应，形成细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯。本发明专利技术采用N,N’‑二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)作为细菌多糖活化剂，毒性较低，环保，成本低，降低疫苗制造的成本。活化多糖时间短，且步骤较少，完成多糖活化到多糖与蛋白质结合整个周期4‑5天时间，而且游离多糖含量较低，动物免疫原性较好。

【技术实现步骤摘要】
一种用DSC作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法
本专利技术属于疫苗制备
，尤其涉及一种用DSC作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法。
技术介绍
目前国内外在细菌多糖蛋白结合疫苗制备时，使用的细菌多糖活化剂为溴化氰(CNBr)、1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)、高碘酸钠、碳二亚胺(EDAC)，此四种多糖活化剂在活化细菌多糖时都有一些不足。如，CNBr为剧毒物品，其用于细菌多糖活化时，对环境造成一定的污染以及存在一些使用的安全隐患；CDAP虽其毒性没有CNBr强，但CDAP价格较为昂贵，增加了疫苗制造的成本；高碘酸钠作为多糖活化剂，其将多糖结构破坏，并将多糖的羟基氧化为醛基，且整个反应周期较长，需要14天左右，且高碘酸钠活化法对多糖结构有破坏，步骤繁多；EDAC作为多糖活化剂，其对多糖结构要求较高，即多糖结构中要含有游离羧基，EDAC活化多糖中的羧基进而与ADH连接，形成多糖-ADH衍生物。基于以上问题，有必要研究其他的细菌多糖活化剂。N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)，英文名为N,N'-Disuccinimidylcarbonate，CAS登记号为74124-79-1，分子式是C9H8N2O7，分子量为256.169，粉末状，用作脱水剂及医药中间体。根据文献报道，N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)目前主要用于氨基酸、蛋白质的缩合剂。
技术实现思路
针对现有细菌多糖活化剂存在的不足，本专利技术提供一种用DSC作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法。本专利技术采用N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)作为细菌多糖活化剂，(1)DSC毒性较低，较CNBr环保；(2)DSC商业价格比CDAP低，降低疫苗制造的成本。(3)DSC与高碘酸钠相比，其活化多糖时间较短10～30min，且步骤较少，完成多糖活化到多糖与蛋白质结合整个周期4-5天时间。本专利技术的技术方案如下：一种用DSC作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，所述制备方法中细菌多糖与蛋白共价结合前，细菌多糖首先与N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在pH为8.0-9.5碱性水溶液条件下进行活化反应，形成细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯。所述细菌多糖与N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)的质量比为1：1-1：3。所述活化反应中细菌多糖以1-20mg/mL的浓度溶解于0.1～0.3mol/L的NaCl溶液中。所述细菌多糖为b型流感嗜血杆菌多糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、肺炎球菌血清型1、2、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，副伤寒沙门菌甲型和副伤寒沙门菌乙型中的任意一种。所述细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯与双功能链接剂反应形成细菌多糖衍生物，细菌多糖衍生物再与载体蛋白在缩合剂的作用下共价结合，形成细菌多糖蛋白结合物。进一步地，所述双功能链接剂为1,6-己二酰肼(ADH)。进一步地，所述载体蛋白为破伤风类毒素(TT)、白喉毒素(DT)和白喉毒素无毒变异体(CRM197)中的任意一种。作为优选，所述方法包括以下步骤：步骤(1)细菌多糖与N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在pH为8.0-9.5碱性水溶液条件下进行活化反应，形成细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯；步骤(2)在pH为8.0-9.5碱性水溶液条件下，加入双功能链接剂与细菌多糖琥珀酰亚胺碳酸酯进行单端共价连接，得到细菌多糖衍生物；步骤(3)细菌多糖衍生物经1-30KD的膜超滤浓缩至多糖浓度为1-15mg/mL，得到超滤浓缩后的细菌多糖衍生物；步骤(4)将超滤浓缩后的细菌多糖衍生物中加入载体蛋白，并在缩合剂作用下反应，形成细菌多糖蛋白结合物，超滤浓缩后的细菌多糖衍生物质量与载体蛋白的质量比为1：0.6-1：2；步骤(5)用凝胶柱进行纯化，收集V0附近的吸收峰，除菌过滤即获得纯化后的细菌多糖蛋白结合物原液，即为细菌多糖蛋白结合疫苗。本专利技术还提供通过所述制备方法得到的细菌多糖蛋白结合疫苗。本专利技术最后还提供N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯在活化细菌多糖中的应用。本专利技术的特点在于，现有技术中DSC用于氨基酸、蛋白质的缩合剂，但是由于DSC在水中发生水解反应，容易影响蛋白缩合过程；故蛋白缩合反应一般都在有机溶剂中进行。故本领域技术人员都觉得DSC不适宜在水中参与反应，但本专利技术发现，虽然DSC在水中会发生部分水解，但是依然能够达到活化细菌多糖的效果，且具有意料不到的优点，如活化时间段、毒性低等。本专利技术采用DSC作为细菌多糖活化剂，DSC毒性较低，较CNBr环保；DSC商业价格比CDAP低，降低疫苗制造的成本。DSC与高碘酸钠相比，其活化多糖时间较短10～30min，且步骤较少，完成多糖活化到多糖与蛋白质结合整个周期4-5天时间。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术采用N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)作为细菌多糖活化剂，毒性较低，环保，成本低，降低疫苗制造的成本。活化多糖时间短，且步骤较少，完成多糖活化到多糖与蛋白质结合整个周期4-5天时间。本专利技术方法不仅操作简便，成本低，适合工业化生产，而且用该方法活化多糖制备得到的衍生进一步与蛋白载体结合获得的多糖蛋白结合物的各项检测结果均符合《中国药典》2015版的标准要求，游离多糖含量低，动物效力试验结果较好。附图说明图1为DSC作为活化剂制备的A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物与A群脑膜炎球菌的效力试验结果对比图；图2为DSC作为活化剂制备的b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合物与b型流感嗜血杆菌多糖的效力试验结果对比图；图3为DSC作为活化剂制备的肺炎球菌19F型多糖蛋白结合物与肺炎球菌19F型多糖的效力试验结果对比图；具体实施方式以下各实施例无特殊说明均为常规技术，各实施例中各种试剂、原料等均为市售产品，各型细菌菌种无特殊说明均购买自中国医学微生物学菌种保藏中心，各种细菌菌多糖、载体蛋均由云南沃森生物技术股份有限公司提供。以下实施例是对本专利技术的技术方案做进一步详细说明，但并不限制本专利技术的保护范围。实施例1A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的制备及其动物有效性试验A群脑膜炎球菌多糖衍生物的制备称取纯化后的A群脑膜炎球菌细菌多糖200mg，用0.2mol/L的NaCl溶液溶解为5mg/ml；称取500mg的DSC，用乙腈溶解为100mg/ml；调A群脑膜炎球菌细菌多糖溶液pH值为8.0～9.5，加入DSC粉末，维持pH值为8.0～9.5反应10min，加入800mg的己二酰肼，维持pH值为8.5～9.0反应40min；用30KD的超滤膜超滤浓缩，冻干即得A群脑膜炎球菌多糖衍生物(MenAps-ADH)。A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的制备称取A群脑膜炎球菌多糖衍生物150mg，溶解于15ml0.2mol/L的NaCl中，加入破伤风类毒素溶液15ml(破伤风类毒素蛋白浓度为10mg/ml)，然后加入碳二亚胺(EDAC)至EDAC浓度为0.1mol/L，维持pH5.5±0.5(2～8℃)反应4小时，得A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物(MenAps-TT)，然后用凝胶柱进行纯化，收集V0附近的吸收峰，除菌过滤即的A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物原液(MenAps-TT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法中细菌多糖与蛋白共价结合前，细菌多糖首先与N,N’‑二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在pH为8.0‑9.5碱性水溶液条件下进行活化反应，形成细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯。

【技术特征摘要】
1.一种细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法中细菌多糖与蛋白共价结合前，细菌多糖首先与N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在pH为8.0-9.5碱性水溶液条件下进行活化反应，形成细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯。2.如权利要求1所述的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述细菌多糖与N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)的质量比为1：1-1：3。3.如权利要求1所述的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述活化反应中细菌多糖以1-20mg/mL的浓度溶解于0.1～0.3mol/L的NaCl溶液中。4.如权利要求1所述的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述细菌多糖为b型流感嗜血杆菌多糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、肺炎球菌血清型1、2、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，副伤寒沙门菌甲型和副伤寒沙门菌乙型中的任意一种。5.如权利要求1～4任一所述的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述细菌多糖的琥珀酰亚胺碳酸酯与双功能链接剂反应形成细菌多糖衍生物，细菌多糖衍生物再与载体蛋白在缩合剂的作用下共价结合，形成细菌多糖蛋白结合物。6.如权利要求5所述的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉秋，钱雯，何建东，范荣坤，王丽丽，陈敏，王铭，陆伟，
申请(专利权)人：云南沃森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53