增强的蛋白质表达制造技术

本发明专利技术总体上涉及具有遗传改变的核酸和细菌细胞，以及制造和使用这些核酸和细菌细胞的方法，该遗传改变导致感兴趣的蛋白质的表达增加。

Enhanced protein expression

The present invention generally relates to nucleic acid and bacterial cells with genetic changes, as well as methods of making and using these nucleic acids and bacterial cells, which alter the expression of proteins of interest.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强的蛋白质表达相关申请的交叉引用本申请要求于2015年2月19日提交、目前未决的美国临时专利申请序列号62/118,382的优先权。序列表的引用命名为“NB40178WOPCT-Sequence-Listing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2015年2月17日，并且大小为27KB，将其以全文通过引用特此结合。专利
本专利技术总体上涉及具有遗传改变的细菌细胞，以及制造和使用此类细胞的方法，该遗传改变导致感兴趣的蛋白质的增加的表达。本专利技术的方面包括革兰氏阳性微生物(例如芽孢杆菌属物种)，这些微生物具有导致感兴趣的蛋白质表达增强的遗传改变。
技术介绍
遗传工程已经允许改进在食品发酵中用作工业生物反应器和细胞工厂的微生物。包括多个芽孢杆菌属物种的革兰氏阳性生物体被用于产生大量有用的蛋白质和代谢产物(参见，例如，Zukowski，“Productionofcommerciallyvaluableproducts[有商业价值的产品的生产]”，在Doi和McGlouglin主编的BiologyofBacilli:ApplicationstoIndustry[杆菌生物学：工业应用]中，巴特沃思-海涅曼出版公司(Butterworth-Heinemann)，斯通哈姆，马萨诸塞州，第311-337页，[1992])。工业中使用的常见芽孢杆菌属物种包括但不限于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。除了在一般工业环境(例如，除了其他用途之外，用于洗涤剂、生物质燃料生产的酶)中使用这些微生物，由于这些微生物的GRAS(通常被认为是安全的)状态，这些芽孢杆菌属物种的菌株是用于生产用于食品和制药工业的蛋白质的天然候选物。在革兰氏阳性生物体中产生的蛋白质的实例包括但不限于酶，例如淀粉酶、中性蛋白酶、碱性(或丝氨酸)蛋白酶和支链淀粉酶。尽管对细菌宿主细胞中蛋白质的生产的理解有所进展，但是仍然需要开发新的表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组菌株。专利技术简述在某些实施例中，本专利技术涉及重组(即，遗传修饰的)细菌(宿主)细胞，以及其用于增加编码感兴趣的蛋白质的感兴趣的基因表达的方法。在一些其他实施例中，本专利技术涉及在本披露的重组(修饰的)细菌宿主细胞中一种或多种感兴趣的蛋白质的增加的生产。在仍然其他实施例中，本专利技术涉及修饰用于表达和/或产生一种或多种感兴趣的蛋白质的细菌宿主细胞的方法。在某些其他实施例中，本专利技术涉及本文所阐述的令人惊奇且意想不到的结果，其表明使用与感兴趣的基因可操作地组合的某些强5’UTR会导致感兴趣的蛋白质的更高表达。因此，在某些实施例中，本专利技术涉及DNA分子，这些DNA分子在5'至3'方向上包含5'非翻译区(5'UTR)和感兴趣的异源基因的编码区。在其他实施例中，本专利技术涉及一种DNA分子，该DNA分子在5'至3'方向上包含5'非翻译区(5'UTR)和感兴趣的异源基因的编码区，其中该5’UTR衍生自来自芽孢杆菌属物种的aprE蛋白酶基因。在其他实施例中，该5’UTR衍生自来自枯草芽孢杆菌的aprE基因。因此，在某些实施例中，用于在表达感兴趣的基因中使用的本披露的5’UTR衍生自枯草芽孢杆菌aprE-5’UTR。在某些其他实施例中，用于在表达感兴趣的基因中使用的本披露的5'UTR衍生自枯草芽孢杆菌aprE-5'UTR，其包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:17所示的核苷酸序列。在某些其他实施例中，本披露的5'UTR包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:17所示的核酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在另一个实施例中，本专利技术涉及包含任何上述DNA序列的载体。在另一个实施例中，本专利技术涉及包含载体的宿主细胞，该载体包含任何上述披露的DNA序列。在另一个方面中，宿主细胞属于芽孢杆菌属物种。在另一个方面中，该芽孢杆菌属物种选自下组，该组由以下各项组成：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在另一个方面中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株。在另一个方面中，芽孢杆菌属菌株是地衣芽孢杆菌菌株。在一个方面中，感兴趣的基因编码一种酶。在另一个方面中，该酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、过水解酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。在本披露的某些其他实施例中，DNA分子包含与实例1，SEQIDNO:3(即：SEQIDNO:3是LAT表达盒，其包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)基因，其具有天然LAT启动子、天然LAT5'UTR、天然LAT信号肽序列和天然LAT转录终止子)中所示的核酸序列具有90％序列同一性的序列。在其他实施例中，DNA分子包含与实例2，SEQIDNO:11(即：SEQIDNO:11包含可操作地与Bacillusderamificans支链淀粉酶(PUL)连接的SEQIDNO:2的aprE-5’UTR，其中支链淀粉酶的N-末端104个氨基酸已被缺失，在本文中称为“PULm104”)所示的核酸序列具有90％序列同一性的序列。在其他实施例中，DNA分子包含与实例3，SEQIDNO:12(即，SEQIDNO:12在5'至3'方向上包含：可操作地与aprE-5'UTR(SEQIDNO:2)组合的rrnIP2启动子(SEQIDNO:20)，该aprE-5'UTR与全长LATORF(即，编码LAT信号肽和成熟LAT多肽)可操作地组合)所示的核酸序列具有90％序列同一性的序列。在某些其他实施例中，DNA分子包含与实例3，SEQIDNO:13(即，SEQIDNO:13在5'至3'方向上包括：与aprE-5'UTR(SEQIDNO:2)可操作地组合的rrnIP2启动子(SEQIDNO:20)，该aprE-5'UTR与LAT信号肽可操作地组合，该LAT信号肽与编码PULm104的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90％序列同一性的序列。在某些其他实施例中，DNA分子包含与实例4，SEQIDNO:14(即，SEQIDNO:14在5'至3'方向上包含：与aprE-5’UTR(SEQIDNO:2)可操作地组合的LAT启动子，该aprE-5’UTR与LAT信号肽可操作地组合，该LAT信号肽与编码成熟AmyS变体多肽的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90％序列同一性的序列。在某些其他实施例中，DNA分子包含与实例4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，该DNA分子在5'至3'方向上包含与编码感兴趣的基因(GOI)的核酸序列可操作地连接的5'非翻译区(5'UTR)核酸序列，其中该5'UTR衍生自芽孢杆菌属物种aprE蛋白酶基因并且其中该5'UTR与其中该5'UTR可操作连接的GOI是异源的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.19 US 62/118,3821.一种DNA分子，该DNA分子在5'至3'方向上包含与编码感兴趣的基因(GOI)的核酸序列可操作地连接的5'非翻译区(5'UTR)核酸序列，其中该5'UTR衍生自芽孢杆菌属物种aprE蛋白酶基因并且其中该5'UTR与其中该5'UTR可操作连接的GOI是异源的。2.如权利要求1所述的DNA分子，其中该5'UTR衍生自来自枯草芽孢杆菌的aprE基因。3.如权利要求1所述的DNA分子，其中该5'UTR包含与SEQIDNO:9具有至少90％序列同一性的序列。4.如权利要求1所述的DNA分子，其中该5'UTR包含与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性的序列。5.如权利要求1所述的DNA分子，其中该5'UTR包含与SEQIDNO:10具有至少90％序列同一性的序列。6.如权利要求1所述的DNA分子，其中该5'UTR包含与SEQIDNO:17具有至少90％序列同一性的序列。7.一种表达盒，包含如权利要求1所述的DNA分子。8.一种宿主细胞，包含如权利要求7所述的表达盒。9.一种载体，包含如权利要求1所述的DNA分子。10.一种宿主细胞，包含如权利要求9所述的载体。11.一种宿主细胞，包含如权利要求1所述的DNA分子。12.根据权利要求8、10或11中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞属于芽孢杆菌属物种。13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中该芽孢杆菌属物种选自下组，该组由以下各项组成：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。14.如权利要求13所述的宿主细胞，其中该芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌。15.如权利要求1所述的DNA分子，其中该感兴趣的基因编码酶。16.如权利要求15所述的DNA分子，其中该感兴趣的基因编码野生型芽孢杆菌属物种的酶或变体芽孢杆菌属物种的酶。17.如权利要求15所述的DNA分子，其中该酶选自下组，该组由以下各项组成：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。18.如权利要求15所述的DNA分子，其中该酶是淀粉酶或支链淀粉酶。19.一种DNA分子，该DNA分子包含与选自下组的序列具有90％序列同一性的序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO:3和11-16。20.一种DNA分子，该DNA分子包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO:3和11-16。21.一种用于增加感兴趣的蛋白质在芽孢杆菌属宿主细胞中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·邦焦尔尼，D·德朗格，G·英格兰德，M·科尔克曼，C·莱夫朗，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US