应用人脂肪衍生的干细胞增殖血清来源的丙肝病毒及其用途制造技术

已经提出在肝外部位的丙肝病毒复制；然而，完全病毒复制仅在肝细胞中得到证实。在此我们显示，新鲜分离自HCV‑感染个体的人脂肪形成的DLK‑1

Use of human adipose derived stem cells to proliferate hepatitis C virus derived from serum and use thereof

Replication of hepatitis C virus at the extrahepatic site has been proposed; however, complete viral replication is confirmed only in hepatocytes. Here we show that freshly isolated from HCV infected individuals who fat formation DLK 1

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】应用人脂肪衍生的干细胞增殖血清来源的丙肝病毒及其用途专利
本专利技术涉及用于增殖丙肝病毒(HCV)的系统和方法以及其用途。专利技术背景HCV为黄病毒科(Flaviviridae)的包膜正链RNA病毒。它含有9.6kb基因组，其始于非翻译区(5’-UTR)，接着是编码结构蛋白(核心、E1和E2)和包括p7、NS2、NS3、NS4和NS5在内的非结构(NS)蛋白的序列(关于综述，参见参考文献1，2)。与乙肝病毒(HBV)的感染不一样，HCV感染为具有肝内表现和肝外表现两者的多层面疾病3，并且HCV可驻留在非肝细胞4-6，其可在病毒持续性和再活化中起一定作用。然而，研究HCV的肝外复制的体外系统严重有限。就原代细胞而言，仅在人和黑猩猩肝细胞中证明血清携带的HCV(HCVser)的直接感染，人和黑猩猩肝细胞难以在培养物中维持，并且还具有在细胞特性上显著的供体间的变化。此外，大多数体外细胞培养方法利用分子克隆，而不是天然病毒(关于综述，参见参考文献7)。这些模型还在非原代细胞中生长病毒，包括最近经报道支持临床HCV分离株的感染的HLZ01肝癌细胞系8。因此，这些数据可外推至实际临床病毒-宿主相互作用的程度仍是一个担忧。因此，仍需要增殖血清携带的丙肝病毒(HCV)的备选系统和方法。专利技术概述提供本概述以呈现本专利技术的概述，从而简要地指出本专利技术的性质和实质。在理解其不用于解释或限制权利要求的范围或含义的情况下提出该概述。在一方面，本公开内容提供用于增殖丙肝病毒(HCV)的基于人脂肪衍生的干细胞(hADSC)的系统，其包括hADSC、适于培养hADSC的培养基和HCV。在一些实施方案中，hADSC为原代细胞或传代细胞，优选第1-15代细胞，更优选第1-6代细胞。在一些实施方案中，hADSC对特异性标记物DLK-1(即Pref-1)呈阳性。在一些实施方案中，HCV来源于感染HCV的个体的血液、血清、血浆或体液，或为临床HCV分离株。在一些实施方案中，HCV具有选自以下的基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何组合，优选基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些实施方案中，所述系统支持HCV的完全复制，包括感染病毒的产生。在另一方面，本公开内容提供用于增殖丙肝病毒(HCV)的方法，其包括在适于培养hADSC的培养基中在适于HCV复制的条件下使用hADSC增殖HCV。在一些实施方案中，hADSC为原代细胞或传代细胞，优选第1-15代细胞，更优选第1-6代细胞。在一些实施方案中，hADSC对特异性标记物DLK-1(即Pref-1)呈阳性。在一些实施方案中，HCV来源于感染HCV的个体的血液、血清、血浆或体液，或为临床HCV分离株。在一些实施方案中，HCV具有选自以下的基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何组合，优选基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些实施方案中，所述方法支持HCV的完全复制。在另一方面，本公开内容提供hADSC用于增殖HCV或进行HCV生命周期分析或诊断HCV感染或筛选抗病毒化合物或表征感染HCV的受试者的这种HCV的用途。在另一方面，本公开内容提供hADSC在制备用于诊断HCV感染或增殖HCV或进行HCV生命周期分析或筛选抗病毒化合物或表征感染HCV的受试者的这种HCV的试剂盒中的用途。在另一方面，本公开内容提供用于诊断受试者中的HCV感染的方法，其包括以下步骤：a)提供hADSC，b)在适于培养hADSC的培养基中使hADSC与获自受试者的生物样品一起孵育，c)培养所述hADSC达足以允许HCV复制的时间，和d)检测HCV复制的水平，其中检测到HCV复制表明所述受试者感染HCV。在一些实施方案中，所述生物样品来源于血液、血清、血浆或体液。在另一方面，本公开内容提供用于筛选抗HCV化合物的方法，其包括以下步骤：a)使hADSC在第一容器的培养基中与HCV在不存在候选化合物的情况下接触；b)确定在不存在候选化合物的情况下在第一容器的培养基中HCV的水平；c)使hADSC在第二容器的培养基中与HCV在存在候选化合物的情况下接触；d)确定在存在候选化合物的情况下在第二容器的培养基中HCV的水平；e)比较在存在候选化合物的情况下的HCV水平与在不存在候选化合物的情况下的HCV水平；和f)当在存在候选化合物的情况下的HCV水平低于在不存在候选化合物的情况下的HCV水平时将该候选化合物鉴定为抗HCV化合物。在一些实施方案中，HCV水平通过测量HCV滴度、HCV核酸水平或HCV多肽水平而确定。在一些实施方案中，候选化合物为选自以下的至少一种：化合物、蛋白、肽、肽模拟物、抗体、核酸、反义核酸、shRNA、核酶和小分子化合物。在一些实施方案中，HCV为选自以下的HCV基因型中的至少一种：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何组合，优选基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b。其它方面描述于下文。附图简述当结合通过举例而非限制的方式所包含的附图阅读时能更好地理解前述概述和下列详述。图1：HCV在体内靶定人脂肪衍生的DLK-1+干细胞。(A)3名HCV(+)个体的脂肪组织(表1)收获自手术伤口并且将RNA提取出用于HCV特异性5’-UTR(223bp)的RT-PCR。也对收获自3名HCV(-)个体的脂肪组织进行平行研究用于比较，HCV(+)血清用作阳性对照。(B)将HCV(+)个体的脂肪组织切碎、匀浆并离心成漂浮物、缓冲液和细胞沉淀的层。将细胞沉淀的红细胞进一步裂解以收获SVF。将RNA从各细胞群中提取出并进行5’-UTR的RT-PCR。在SVF细胞中而未在漂浮物中检测到病毒转录物(左图)。SVF细胞进一步免疫分离成DLK-1-和DLK-1+细胞，并将RNA单独提取出用于RT-PCR。病毒转录物存在于DLK-1+细胞中，而不存在于DLK-1-细胞(右图)。数据代表利用来自3名HCV(+)供体的细胞的3个实验。(C)将分离自3名HCV感染个体的DLK-1-和DLK-1+细胞的RNA提取出用于HCV负链RNA的RT-PCR。分离自HCV(+)个体的原代人干细胞(PHH)用作阳性对照。(D)将分离自HCV(-)和HCV(+)个体的DLK-1-(图b和e)和DLK-1+细胞(图c和f)离心到细胞离心涂片器载玻片(cytospinslide)上用于病毒NS5的免疫细胞化学(c中的棕色标记)和苏木精染色(核中的蓝色标记)。用小鼠IgG1对照抗体染色未分级分离的SVF细胞(图a和d)用作阴性对照。数据代表来自3名HCV(+)和3名HCV(-)供体的样品。(E)将来自HCV(+)或HCV(-)个体的脂肪组织在同一切片上针对DLK-1(红色标记，在图b、c和h中的箭头)和针对病毒NS5(棕色标记，在图e和f中的箭头)和苏木精(蓝色标记，图d-f和i-j)进本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于增殖丙肝病毒(HCV)的基于人脂肪衍生的干细胞(hADSC)的系统，其包括hADSC、适于培养hADSC的培养基和HCV。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于增殖丙肝病毒(HCV)的基于人脂肪衍生的干细胞(hADSC)的系统，其包括hADSC、适于培养hADSC的培养基和HCV。2.权利要求1的系统，其中hADSC是原代细胞或传代细胞，优选第1-15代细胞，更优选第1-6代细胞。3.权利要求1-2中任一项的系统，其中HCV源自被HCV感染的个体的血液、血清、血浆或体液，或是临床HCV分离株。4.权利要求1-3中任一项的系统，其中HCV具有基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a，或其任何组合，优选基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。5.权利要求1-4中任一项的系统，其中所述系统支持HCV的完全复制。6.用于增殖丙肝病毒(HCV)的方法，包括在适于培养hADSC的培养基中在适于HCV复制的条件下使用hADSC增殖HCV。7.权利要求6的方法，其中hADSC是原代细胞或传代细胞，优选第1-15代细胞，更优选第1-6代细胞。8.权利要求6-7中任一项的方法，其中HCV源自被HCV感染的个体的血液、血清、血浆或体液，或是临床HCV分离株。9.权利要求6-8中任一项的方法，其中HCV具有基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a，或其任何组合，优选基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。10.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述方法支持HCV的完全复制。11.hADSC用于增殖HCV，或进行HCV生命周期分析，或诊断HCV感染，或筛选抗病毒化合物，或表征被HCV感染的受试者的所述HCV的用途。12.hADSC在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断HCV感...

【专利技术属性】
技术研发人员：林成龙，
申请(专利权)人：先锋生药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：维尔京群岛,VG