用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡制造技术

本发明专利技术涉及用作治疗炎性病变和免疫病变的免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡本专利技术涉及用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。特别地，本专利技术涉及用作治疗炎性和免疫病变的免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。虽然人们对基质间充质干细胞的免疫调节特性的兴趣和临床应用增加了，但是其效果再现性有争议并且涉及到的机制仅仅部分被阐明了。间充质基质细胞(MSC)在体外、动物模型和临床应用中显示出免疫调控特性，例如在移植物抗宿主病中(参见Nauta2007,Zhao2010,Caimi2010的论文)。然而，其作用机制还没有被完全阐明。特别地，虽然关于MSC对活化T淋巴细胞的免疫抑制作用已有广泛研究(Krampera,2003)且揭示了多个参与因子，但是关于MSC对B淋巴细胞的作用和作用机制非常有争议(Corcione2006,Tabera2008,Comoli2008,Traggiai2008,Rasmussen2007)。鉴于有报导称MSC与B细胞的相互作用存在种间差异（人与小鼠）(Renseneb,2009)，下面仅讨论从人细胞获得的结果。总的来说，MSC-B淋巴细胞相互作用被认为介导可溶因子，并且确实有报导称这些因子对B淋巴细胞比对T淋巴细胞有更重要的作用(Augello,2006)。如上面报导的，MSC对B淋巴细胞的作用似乎尚不明确。事实上，既有报导称MCS对B淋巴细胞的抗体增殖、分化和生成有抑制作用(Corcione2006,Tabera2008,Comoli2008)也有报导称有刺激作用(Traggiai2008,Rasmussen2007)。有趣的是，制得注意的是，在某些情况下，MSC起抗原呈递细胞的作用(Chan,2006)，并由此将免疫反应放大。这种现象似乎可见于某些特定的环境条件，例如低水平γ-干扰素存在下(Chan,2006)。根据一项关于MSC与B淋巴细胞相互作用的研究，根据用于B细胞的刺激强度或供体来源，MSC会表现出相反的作用(抑制或刺激)(Rasmussen,2007)。这些相互冲突并且不可预知的结果阻碍了MSC在复杂自体免疫疾病中的应用。鉴于上述情况，很显然需要提供新的治疗方法来治疗炎性和免疫疾病并克服现有技术的缺陷。近期，已发现免疫细胞的多种相互作用由微囊泡(MV)或微粒（如很多细胞表型分泌的膜包被体）介导(Théry,2009)。已经描述了多种MV种类，大小为50～1000nm或更大，并且根据其来源的胞内隔室而有不同的结构和生化特性。越来越多的实验证据显示：通过蛋白、mRNA和微RNA转运，MV在细胞间通信中起基础作用(Valadi,2007;Camussi,2010)。已知，MV对多种细胞表型（如树突细胞或T淋巴细胞）具有免疫反应载体的作用。从表达肿瘤抗原的树突细胞中分离的微囊泡已在两项I期临床试验中用于黑素瘤患者和肺癌患者(Escudier,2005;Morse,2005)，用于刺激肿瘤免疫反应。这些研究显示MV对人系统性应用是安全的，由此激励个人患者临床应用的研究。PRobbins等研究了有免疫抑制活性的外来体（exosome）的应用(US20060116321)，该项研究从不同的细胞类型分离外来体，所述细胞类型包括抗原呈递细胞(树突细胞和巨噬细胞)。类似地，已有人提出将来自树突细胞的微囊泡用于免疫治疗(Lamparsky,US6812023)，例如预防不希望发生的自体抗原或移植物抗原引发的免疫反应，或用于降低过度抗原反应(MattewsAlbertL,US20020004041)。现有技术还研究了将抗原呈递细胞的外来体用作疫苗载体(DelcayreA,US20060222654)或用作抗肿瘤反应发生器(DelcayreA,US7704964)。现有技术研究了来自内皮细胞（优选内皮祖细胞）的微囊泡，例如这些微囊泡有望在胰岛胰腺内皮细胞移植治疗1型糖尿病或2型糖尿病中作为佐剂。佐剂效应能使移植的胰岛存活并具有功能(CantaluppiV,US20100233216)。再者，有报导称，当所述两种细胞的细胞群由渗透膜分开时，仍会发生MSC对B淋巴细胞的抑制作用，这一观察结果被认为是支持了可溶介体的存在(Corcione,2006;Augello,2005)。然而，当使用MSC培养物上清液时，没有发生所述抑制作用(Corcione,2006)或仅发生部分抑制(Augello,2005)。因此，目前认为：MSC完全抑制需要细胞间接触或B淋巴细胞信号释放(Corcione,2006)。对间充质干细胞而言，已有报道称：在动物模型中，来自间充质干细胞的微囊泡(MSC-MV)可能是与给予MSC相关的抗凋亡和促再生作用的介体(Bruno2009;Herrera,2009;Cats,2011)。本专利技术的专利技术人现在发现：分离自干细胞的微囊泡适合于有效介导对B淋巴细胞的免疫抑制作用。事实上，本专利技术专利技术人在间充质干细胞产生微粒中鉴定到了介导间充质干细胞对B淋巴细胞抑制作用的特异性介体，也称为微囊泡(MV)，这些微囊泡最近被认作是细胞间通信的介体。因此，来自间充质干细胞的微囊泡或外来体能有利地用作免疫抑制剂，特别是用于慢性炎性病变和自体免疫疾病，如1型糖尿病。特别地，已发现：从间充质干细胞培养基中获得的MV对于B淋巴细胞经CpG刺激后的抗体增殖、分化和生成有强烈的剂量依赖性效果。使用荧光标记，FACS和共聚焦显微分析都显示MV与CpG刺激的B淋巴细胞相关联但是不与T淋巴细胞、树突细胞和NK细胞之类其它淋巴细胞相关联，这一结果进一步支持测得效果具有特异性的观点。这些结果提示：间充质干细胞产生的MV是间充质干细胞对B淋巴细胞抑制作用的载体。因此，特定培养条件下MSC产生的MV可代替MSC细胞本身用于治疗，并且在标准化、便于操作、安全性和有效性方面有显著优势。如免疫球蛋白分泌减少所示，使用MSC和MSC-MV还能抑制B淋巴细胞的功能。另外，还发现MSC-MV浓度与B细胞增殖抑制和分化抑制之间线性相关。为了检验观察到的现象是否是由PBMC中其他细胞群的相互作用所介导，在如前所述实验条件下用荧光染料标记MSC-MV，用FACS和共聚焦显微分析检验MSC-MV与不同细胞表型的关联，不同细胞表型各自用特异性细胞表面标志的荧光抗体标记。MSC-MV表现为仅仅与B淋巴细胞关联，而不与T淋巴细胞、NK和树突细胞关联。这些数据提示：MSC对B细胞的抑制作用很大程度上由MV的释放来介导，即便或许不是完全由此介导。另外，下面报导的实验数据显示了MSC-MV的体内抗炎性作用。特别地，溃疡性结肠炎动物模型获得的结果显示临床改善和炎症（flogosis）指数降低。因此，使用MSC-MV代替完整的MSC活细胞在安全性和便于操作方面提供了一系列有意义的便利。另外，使用MSC-MV提供了生产和临床应用的便利。就生产而言的便利有如下这些：-MSC-MV能够在培养基中通过MSC的持续释放来生产，并能通过超滤/超速离心来分离。-能用生物反应器来放大生产，所述生物反应器能使大量细胞适应三维结构，并且便于分离连续的MSC-MV产物流。-能通过添加多种物质(例如细胞因子如γ干扰素)从而基于培养基组成或基于可调的物理条件(如氧气压力)来刺激细胞生产MSC-MV本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离自间充质干细胞的微囊泡用于制备药剂的用途，所述药剂用于免疫抑制治疗。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.28 IT RM2011A0004031.分离自间充质干细胞的微囊泡用于制备药剂的用途，所述药剂用于免疫抑制治疗。2.如权利要求1所述的用途，所述免疫抑制治疗用于治疗急性炎性疾病和慢性炎性疾病以及自体免疫疾病。3.如权利要求1所述的用途，所述免疫抑制治疗用于治疗和预防移植排斥。4.如权利要求1所述的用途，所述免疫抑制治疗用于治疗和预防移植物抗宿主病。5.如权利要求1所述的用途，所述免疫抑制治疗用于抑制同种/异种细胞移植或基因治疗引起的免疫反应。6.一种药物组合物，所述药物组合物包含下列...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·穆拉卡，A·费拉布拉奇，
申请(专利权)人：冷冻保藏股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH