一种山羊细胞克隆胚胎培养液及培养方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种山羊细胞克隆胚胎培养液及其培养方法，所述山羊细胞克隆胚胎培养液包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100‑120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基。该培养液对现有技术的DMEM培养基和M16培养基进行改良，制备出培养液的A液和B液，然后采用分阶段培养细胞，二细胞胚胎数、四细胞胚胎数、桑葚胚数、囊胚数、囊胚植入母体后成活数均较高，山羊受精卵的体外发育率总体较DMEM培养基和M16培养基高。

Goat cell cloned embryo culture solution and culture method

The invention belongs to the technical field of biological engineering, and discloses a goat cell clone embryo culture medium and culture method, the goat cell clone embryo culture medium including A solution and B solution, the A per liter of liquid containing 0.2mg 350mg, ferrous nitrate, potassium chloride 100 120mg citric acid, 100mg the allowance for sodium dihydrogen phosphate, DMEM high glucose liquid medium. The DMEM medium on the existing technology and M16 medium modified prepared medium A solution and B solution, and then by stages of cultured cells, two cell embryos, four cell embryos, morula, blastocyst, number of blastocyst maternal survival number were higher fertilization in goats the overall rate of egg development in vitro than in DMEM medium and M16 culture medium.

【技术实现步骤摘要】
一种山羊细胞克隆胚胎培养液及培养方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种山羊细胞克隆胚胎培养液及培养方法。
技术介绍
山羊是一种重要的经济动物，生产肉、绒、奶等经济产品，特别是山羊奶具有巨大的市场潜力，如果获得、保持优质的山羊品种遗传资源，是对现有种群进行改良，成为山羊大规模养殖的迫切问题。克隆胚胎属于克隆的一种方法，最常用的就是体细胞克隆技术，是指采用核移植的方法，利用细胞拆合或者细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或者含少量细胞质的细胞核质体作为核供体，将核供体移入核受体中构建重组胚胎(受精卵)，然后核供体在去核卵母细胞的包质中被重新编程、发育的过程。体细胞克隆技术在生物、医学领域具有许多成功案例，对于研究动物胚胎发育、研究胚胎发育机理、药物治疗作用、克隆动物等方面具有重要的应用价值。合理利用克隆胚胎技术，构建山羊细胞克隆胚胎是保持山羊优质遗传资源的关键手段，随着生物科学技术的不断发展，克隆胚胎技术逐渐成熟并推广应用。现有技术中，M16培养基是胚胎移植之前用于培养胚胎的常用培养基，但是这种培养基是基础通用的培养基，虽然具有广泛适用性，但是针对性不强，一般需要的克隆胚胎发育率较低。
技术实现思路
本专利技术提供的一种山羊细胞克隆胚胎培养液，针对性强，解决了M16培养基一般需要的克隆胚胎发育率较低的问题。本专利技术提供的一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100-120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有10-20mg的胎牛血清、120-150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。本专利技术还提供了一种山羊细胞克隆胚胎的培养方法，包括以下步骤：步骤1，将重组好的山羊受精卵置于权利要求1所述的A液中离体培养，直至胚胎发育到二细胞期；步骤2，将发育到二细胞期的胚胎用0.85g/100ml氯化钠溶液清洗后，接着置于权利要求1所述的B液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。与现有技术相比，本专利技术提供的一种山羊细胞克隆胚胎培养液具有以下有益效果：(1)对现有技术的DMEM培养基和M16培养基进行改良，制备出培养液的A液和B液，然后采用分阶段培养细胞，二细胞胚胎数、四细胞胚胎数、桑葚胚数、囊胚数、囊胚植入母体后成活率均较高，山羊受精卵的体外发育率总体较DMEM培养基和M16培养基高。(2)具体实施方式中，比较A、F、G、H组，发现添加柠檬酸和苹果酸，最后获得的囊胚数高于不添加柠檬酸、不添加苹果酸或者柠檬酸以及苹果酸均不添加的F、G、H组，说明柠檬酸和苹果酸有助于提高山羊受精卵体外发育率和囊胚植入母体后成活数。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，所用试剂均为市售，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。本专利技术提供的一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100-120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有10-20mg的胎牛血清、120-150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。其中，DMEM高糖型液体培养基、M16液体培养基分别是市售的DMEM高糖型培养基、M16培养基按照说明书配制成液体后制成。其中，所述苹果酸是L-苹果酸、D-苹果酸或者混合物DL-苹果酸。实施例1一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有15mg的胎牛血清、150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。所述苹果酸是L-苹果酸。实施例2一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有17mg的胎牛血清、120mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。所述苹果酸是D-苹果酸。实施例3一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、110mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有10mg的胎牛血清、130mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。所述苹果酸是混合物DL-苹果酸。实施例4一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、115mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有20mg的胎牛血清、140mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。所述苹果酸是L-苹果酸、D-苹果酸或者混合物DL-苹果酸。实施例1-4的培养液配制时，先配制好DMEM高糖型液体培养基，然后按照配方称取各组分，混匀，充分溶解即可。本专利技术还提供了一种山羊细胞克隆胚胎的培养方法，首先按常规方式制备重组好的山羊受精卵，然后利用下述实施例5的方法使受精卵发育，培养至细胞克隆胚胎的囊胚。下面以实施例1中的培养液配方为例，说明实施例5的方法步骤。实施例5一种山羊细胞克隆胚胎的培养方法，包括以下步骤：步骤1，将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的A液中离体培养，直至胚胎发育到二细胞期；步骤2，将发育到二细胞期的胚胎用0.85g/100ml氯化钠溶液清洗后，接着置于实施例1所述的B液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。发育至囊胚后便可按照常规方法植物母体子宫，进行分化发育。一、不同培养液的比较我们将重组的山羊受精卵置于不同培养液中培养，培养方法均同实施例5，只是不同阶段采用的培养液不同，设计以下几组试验：A组：采用实施例1的培养液和实施例5的培养方法进行胚胎发育培养。B组：将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的A液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。C组：将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的B液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。D组：将重组好的山羊受精卵置于DMEM高糖型液体培养基中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。E组：将重组好的山羊受精卵置于M16液体培养基中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。F组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的A液中柠檬酸去除，将B液中的苹果酸去除。G组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的A液中柠檬酸去除。H组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的B液中的苹果酸去除。观察记录上述分组中山羊受精卵的体外发育率。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊细胞克隆胚胎培养液，其特征在于，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100‑120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有10‑20mg的胎牛血清、120‑150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。

【技术特征摘要】
1.一种山羊细胞克隆胚胎培养液，其特征在于，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100-120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；每升所述B液中含有10-20mg的胎牛血清、120-150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。2.根据权利要求1所述的山羊细胞克隆胚胎培养液，其特征在于，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，李文雍，吴晓庆，谢娟，章孝荣，凌英会，鞠明，
申请(专利权)人：阜阳师范学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34