一种靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向性融合蛋白ALA的制备方法及其应用，所述融合蛋白的制备包括：化学合成包含尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的ATF区、以及可以被特异性酶切的连接肽段和东亚钳蝎抗肿瘤肽AGAP的基因序列，将这一序列通过限制性内切酶位点插入到表达载体上获得重组子。将该重组子转化到毕赤酵母中，筛选获得表达菌。将该菌接种培养，经甲醇诱导表达，收集发酵液，Ni

Preparation and application of a targeted anti tumor fusion protein ALA

Preparation and application of the invention discloses a method for targeting fusion protein ALA, preparation including the fusion protein: chemical synthesis containing urokinase type plasminogen activator (uPA) gene sequence of antitumor peptide AGAP connection peptide ATF, and can be specific enzyme digestion and scorpion scorpion, this sequence by restriction endonuclease and inserted into the expression vector to obtain recombinant. The recombinant was transformed into Pichia pastoris, and the expressed strain was obtained. The bacteria were inoculated, cultured and expressed by methanol, and the fermentation broth was collected, Ni

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA的制备和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA的制备方法和该融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)在恶性肿瘤细胞表面高表达，成为评价肿瘤恶性化程度及预后的标准之一，也成为一个重要的抗癌药物靶点。肿瘤侵袭转移是一个多步骤、多环节的复杂过程，主要包括以下几个步骤：肿瘤细胞周围细胞外基质及基底膜的降解、肿瘤细胞的粘附与迁移、肿瘤细胞的增殖和血管生成。细胞外基质及基底膜的降解主要由纤溶酶原激活剂系统及金属蛋白酶系统两个基质降解酶系统完成。借助于uPAR，肿瘤细胞将其分泌的或细胞外的uPA浓集于细胞表面；uPA与uPAR特异性结合后，多条通路被激活，从而发挥其在肿瘤演进中的多种功能。这些功能主要包括两方面：一是细胞内的多种信号通路被活化，包括癌基因表达的上调、刺激细胞粘附、调节化学趋化及MAPK通路的激活；二是细胞外的蛋白水解作用。pro-uPA被激活为uPA，与uPAR结合的uPA大大增强了激活纤溶酶原为纤溶酶的活性。纤溶酶能够降解细胞外基质中的多种糖蛋白(如：纤连蛋白、层连蛋白等)以及蛋白多糖分子中的蛋白核心。此外，纤溶酶还能激活基质金属蛋白酶系统中的前胶原酶、弹性蛋白酶和前基质水解酶等，促进胶原、弹性蛋白以及其它基质蛋白成分的降解。细胞外基质及基底膜的降解，使得肿瘤细胞能够穿过基底膜进入血管，而产生肿瘤转移。ATF是uPA的氨基末端片段，包括1-47位氨基酸的生长因子结构域和48-134位氨基酸的Kringle结构域。ATF包含了所有与uPAR结合的结构域，但不包括激活尿激酶型纤溶酶原激活物系统的催化结构域，它能够与uPAR高特异性的结合解离常数约为0.2nM。因此，ATF不仅能够靶向在肿瘤细胞表面高表达的uPAR，而且能够与uPA竞争性的结合uPAR，抑制肿瘤环境中尿激酶型纤溶酶原激活物系统的过度活化。东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(analgesic-antitumorpeptide，AGAP)是由刘岩峰等人于2003年从东亚钳蝎蝎毒中提取的一种多肽，为单一肽链的单纯碱性多肽，等电点大于10。含有碱性氨基酸，还富含疏水性氨基酸。实验证明AGAP具有良好的抗肿瘤作用，然而AGAP在蝎毒中的含量较低以及繁琐的分离纯化工艺很难满足药物开发的需要，近年来利用基因工程技术制备蛋白质的研究有望能够突破这一瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提高抗肿瘤药物的靶向性，降低药物毒副作用，提供一种靶向性抗肿瘤融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在抗肿瘤药物中的应用。本专利技术提供的一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其氨基酸序列为SEQIDNO：4。编码上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列为：SEQIDNO：5。一种质粒，含有上述融合蛋白的核苷酸序列。它是将编码ALA的核苷酸片段克隆至真核表达载体后获得的重组子。一种毕赤酵母菌工程菌，含有上述的重组载体。是将重组子转化至毕赤酵母菌中，构建的表达ALA融合蛋白的工程菌。一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。编码所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，N端由尿激酶型纤溶酶原激活剂的1-135位氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQIDNO：1。所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，连接肽氨基酸序列为SEQIDNO：3。含有所述的如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列的表达质粒。含有所述质粒的表达融合蛋白质ALA的工程菌。一种制备所述的融合蛋白质ALA的方法，包括如下步骤：(1)将SEQIDNO：5所示的基因连接到毕赤酵母过表达载体上，获得重组子；(2)将重组子电转化到毕赤酵母菌中，构建毕赤酵母工程菌；(3)将工程菌接种在含博莱霉素的YPD培养基中，在28℃、250r条件下，摇床培养16-18小时，接种1％至表达培养基中28℃、250r摇瓶培养16-18小时，至OD600为2-6，加入甲醇使终浓度为1％，诱导表达24小时，5000g，离心5min，收集上清；(4)将收集到的上清置于平衡缓冲液中进行透析过夜；(5)将平衡好的上清液过Ni柱，利用含有咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集250mM咪唑浓度下的蛋白洗脱液；(6)将收集到的蛋白洗脱液用磷酸盐缓冲液透析去除其它杂质，得到有活性的ALA融合蛋白。所述的靶向性融合蛋白ALA在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤为有uPAR受体表达的肿瘤。所述的肿瘤细胞系为肠癌SG-7901、肺癌A549、乳腺癌MDA-MB231或MCF-7。在本专利技术的靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA中，尿激酶的EGF样区和Kringle区合称为ATF，ATF区可以靶向性结合到肿瘤细胞中高表达的尿激酶受体上。融合蛋白质ALA的连接肽中含有酶切位点，可以被肿瘤组织中的酶切割，从而发挥抗肿瘤肽的抑瘤作用，而对尿激酶受体不表达或低表达的正常细胞无毒，具有成为理想的靶向性抗肿瘤融合蛋白的潜力。有益效果：与现有技术相比，本专利技术所提供的靶向性抗肿瘤融合蛋白质ALA可在抗肿瘤药物中应用。实验证实该融合蛋白质对包括大肠癌SG-7901细胞、肺癌A549细胞、乳腺癌MDA-MB231细胞等肿瘤细胞系均有明显的抑制作用，而对无uPAR受体的HEK293和L029细胞则无明显抑制作用。附图说明图1显示用于表达融合蛋白的重组质粒构建示意图。图2显示融合蛋白亲和层析纯化分步洗脱图。其中1：Marker；2：发酵液上清；3：穿过部分；4：0mM咪唑洗脱；5，6：20mM咪唑洗脱；7，8：50mM咪唑洗脱；9，10：100mM咪唑洗脱；11，12：200mM咪唑洗脱；13，14：250mM咪唑洗脱；15，16：500mM咪唑洗脱。图3是纯化后融合蛋白的检测结果图：图3A为融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图，3B为WesternBlot结果图。图4是融合蛋白抑制细胞增殖实验结果图：4A为融合蛋白对4种肿瘤细胞的生长抑制结果图；4B为融合蛋白对两种正常细胞株生长的影响图。图5是融合蛋白体内制肿瘤生长曲线图：A为融合蛋白对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用图；B为融合蛋白对乳腺癌MDA-MB231细胞裸鼠移图；C为融合蛋白对胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用图。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1：靶向性融合蛋白质ALA重组表达载体和工程菌的构建A.重组表达载体构建：按照前文SEQIDNO：5所述核酸序列，合成基因序列，上下游分别引入EcoR1和Xba1的酶切位点，合成序列直接克隆入南京金斯瑞公司提供的PUC-57空载体中，并热击转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定筛选阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，提取质粒DNA，利用NcoI、EcoRI双酶切本质粒和pPICAa-A空质粒，回收目的片段和pPICAa-A载体粘性末端片段，在T4DNA连接酶(Takara)的存在下将目的片段插入到同样酶切的质粒空载体中，得到重组表达载体，命名为pPICAaA-ALA，并转化至大肠杆菌DH5α，进菌落PCR挑选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：uPAR特异性靶向蛋白‑连接肽‑抗肿瘤肽；其中所述uPAR特异性靶向蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中所述抗肿瘤肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向性抗肿瘤融合蛋白ALA，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：uPAR特异性靶向蛋白-连接肽-抗肿瘤肽；其中所述uPAR特异性靶向蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，其中所述抗肿瘤肽具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽C端含有一个酶切位点，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。3.根据权利要求1和2所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。4.根据权利要求1至3所示的融合蛋白的编码基因，其特征在于基因序列经过密码子优化后适宜在酵母系统中表达，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。5.一种含有权利要求4所述编码基因的质粒。6.一种含有权利要求5所述质粒的工程菌。7.根据权利要求1至3所述融合蛋白ALA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将SEQIDNO：5所示的基因连接到毕赤酵母过表达载体上，获得重组子；(2)将重组子电转化到毕赤酵母菌中，筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀峰，刘吉华，吴娟娟，沈辰，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32