一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途制造技术

一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途，其含有针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述单链抗体hPDPNscFV的轻链可变区和重链可变区之间由连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该嵌合抗原受体中的scFV具有抗人PDPN的特异性，能特异性结合到靶抗原上，发挥针对胶质瘤细胞的细胞毒效应，所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于PDPN阳性的肿瘤治疗，尤其对表面PDPN阳性的胶质瘤细胞具有特异杀伤作用。

Human chimeric antigen receptor targeting PDPN gene and uses thereof

A PDPN gene targeted human chimeric antigen receptor and the use of the hPDPNscFV and T cells containing ScFv against human PDPN antigen stimulated signal transduction, which, between the light chain variable region of the antibody hPDPNscFV and heavy chain variable regions connected by the connecting peptide, the connecting peptide amino acid sequence SEQ ID NO.5 shows, the specificity of the chimeric antigen receptor in scFV with anti human PDPN, specific binding to the target antigen, play for cytotoxic effect of glioma cells, chimeric antigen receptor can be used for the modification of T lymph cells, modified T cells for PDPN positive tumor therapy, especially with a specific killing effect on the surface of PDPN positive glioma cells.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
设计活体外产生的自体抗原特异性T细胞，通过肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是治疗肿瘤的有前景的方法。目前，已证实肿瘤特异性T细胞的分离及转移在治疗黑色素瘤、血液肿瘤取得了良好的临床结果。嵌合抗原受体(CAR，chimericantigenreceptor)通过外源性基因转导技术获得T细胞新颖的特异性。CAR作为合成受体，由一个能够识别肿瘤相关特异性抗原的scFV(单链抗体，由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成)，通过铰链结构与能够活化T细胞的单一融合分子中的一个或多个信号转导结构域相关联的靶向部分结合，这样scFV通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联，通过scFV识别肿瘤特异性抗原，产生T细胞活化的信号，经过回输患者体内，活化增殖T细胞，能够以非MHC限制性的模式表达较强的抗肿瘤作用。第一代CAR的信号转导结构域衍生自CD3ζ的细胞质区域或Fc受体伽马链。然而，第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少的不足。第二代CAR在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供了T细胞活化的两种信号，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，来提高CAR改造的T细胞存活率及增殖率，并增加了细胞因子分泌功能，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制。PDPN(Podoplanin)是一种在淋巴内皮中表达的I型跨膜粘蛋白样糖蛋白，被认为是肿瘤研究中较特异的淋巴标志物。在多种实体瘤中高表达，如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌，恶性间皮瘤，卡波西肉瘤，睾丸精原细胞瘤，脑肿瘤等。PDPN的表达与肿瘤恶性程度进展、上皮间质转化及转移相关。在胶质瘤中，PDPN的表达与肿瘤恶性程度相关。PDPN主要在间充质胶质母细胞瘤中高表达。因此，PDPN是一种用于免疫治疗胶质瘤等肿瘤的吸引人的靶抗原。而鼠源的scFv在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(HAMA)，严重影响修饰后的T细胞对PDPN阳性肿瘤细胞的杀伤作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途，采用了人源化的scFv，能够避免宿主抗移植物反应，该嵌合抗原受体中的scFV具有抗人PDPN的特异性，能特异性结合到靶抗原上，发挥针对胶质瘤细胞的细胞毒效应，所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于PDPN阳性的肿瘤治疗，尤其对表面PDPN阳性的胶质瘤细胞具有特异杀伤作用。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其含有针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述单链抗体hPDPNscFV的轻链可变区和重链可变区之间由连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5示。进一步，所述单链抗体hPDPNscFV中，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。又进一步，所述所述单链抗体hPDPNscFV中，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步，所述T细胞刺激信号转导结构为以人CD137铰链区和人CD3ζ胞内区结构串联组成的结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。优选地，靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体由针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV、人CD137胞内区和人CD3ζ胞内区串联组成hPDPNscFV-CD137-CD3ζ，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。进一步，所述靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。又优选地，所述靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体由抗人PDPN单克隆抗体scFV、人CD28胞内区、人CD137(即4-1BB)胞内区和人CD3ζ胞内区结构串联组成。进一步，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有信号肽CD8a，该信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。本专利技术提供携带上述靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体编码基因的表达载体，尤其是嵌合抗原受体PDPNscFV-CD137-CD3ζ编码基因的表达载体。本专利技术所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于PDPN阳性的肿瘤治疗，尤其是表面PDPN阳性的胶质瘤。鼠源的单链抗体在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(HAMA)，严重影响修饰后的T细胞对PDPN阳性肿瘤细胞的杀伤作用，本专利技术针对抗鼠PDPN单克隆抗体的scFV基因序列，采用框架置换及随机突变的方案，分别将重链和轻链中CDR区氨基酸与人源的框架进行组合，构建人源化的抗体重链和轻链序列，并通过重叠延伸PCR技术加入linker形成抗人PDPN特异性scFV，人源化的单链抗体hPDPNscFV将抗体中的框架区替换为人源的氨基酸序列，可以最大程度额避免HAMA。本专利技术利用抗人PDPN单链抗体构建出嵌合抗原受体即hPDPN-CAR，使用信号肽CD8α引导嵌合抗原受体跨膜表达，使用P2A将截短型的EGFR与嵌合抗原受体阅读框连接起来(参见图1)，实现在一个启动子的调控下控制两个基因的表达，能以EGFRt的表达水平间接反映hPDPN-CAR的表达水平，可以通过检测EGFR的表达间接反映嵌合抗原受体的表达效率，表达该嵌合抗原受体的T细胞具有独特性，其具有肿瘤特异性杀伤功能，能够在临床中用于肿瘤表面PDPN阳性的肿瘤治疗，尤其是表面PDPN阳性的胶质瘤。进一步，本专利技术利用基因工程编辑技术获得编码嵌合抗原受体hPDPNscFV-CD137-CD3ζ的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、LDH细胞毒性分析实验、ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明经本专利技术的嵌合抗原受体修饰的T细胞对胶质瘤细胞具有特异杀伤作用，能够特异性识别并杀伤表面PDPN阳性的肿瘤细胞，因此，本专利技术所述的嵌合抗原受体可应用于胶质瘤免疫治疗中。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，将具有较强免疫原性的鼠源框架区域替换为人源氨基酸序列，最大程度的避免HAMA反应，人源后的嵌合抗原受体，具有抗人PDPN的特异性，特异性结合到靶抗原上，并发挥针对胶质瘤细胞的细胞毒效应，经所述嵌合抗原受体能用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于表面PDPN阳性的肿瘤治疗，尤其对表面PDPN阳性的胶质瘤具有特异杀伤作用。附图说明图1为本专利技术的抗人hPDPN嵌合抗原受体(hPDPN-CAR)与P2A-EGFRt的结构示意图。图2为本专利技术实施例1的hPDPN单链抗体表达载体酶切电泳图。图3为本专利技术实施例1的hPDPN单链抗体SDS-PAGE结果图。图4为本专利技术实施例1流式细胞仪检测鼠源PDPNscFV单链抗体与靶蛋白结合水平结果图。图5为本专利技术实施例1流式细胞仪检测hPDPNscFV单链抗体与靶蛋白结合水平结果图。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其含有针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述单链抗体hPDPNscFV的轻链可变区和重链可变区之间由连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其含有针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述单链抗体hPDPNscFV的轻链可变区和重链可变区之间由连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5示。2.根据权利要求1所述的靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述单链抗体hPDPNscFV中，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求2所述的靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述单链抗体hPDPNscFV中，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1所述的靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞刺激信号转导结构为以人CD137铰链区和人CD3ζ胞内区结构串联组成的结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。5.根据权利要求1所述的靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，其由针对人PDPN抗原的单链抗体hPDPNscFV、人...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱剑虹，钟俊杰，王智富，汤奇胜，
申请(专利权)人：上海神因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31