本发明专利技术涉及基因工程领域，公开了肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白及其制备方法和应用。具体地，所述重组蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。本发明专利技术采用基因工程的方法获得proSP‑B重组蛋白，该proSP‑B重组蛋白的细胞毒性低，且表现出良好的抗菌活性，具有良好的实际应用前景。
Recombinant protein of lung surfactant protein B propeptide and preparation method and application thereof
The invention relates to the field of gene engineering, and discloses a recombinant protein of the lung surfactant protein B precursor, a preparation method and an application thereof. Specifically, the recombinant protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, or SEQ ID in the N-terminal NO:1 and / or carboxyl terminal amino acid sequence tags are connected. The invention adopts gene engineering method to obtain proSP B recombinant protein, the cytotoxicity of proSP recombinant B protein, and showed good antibacterial activity, has good application prospects.
【技术实现步骤摘要】
肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白、编码该重组蛋白的核酸、一种重组质粒、一种重组菌株、一种制备肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白的方法以及它们的应用。
技术介绍
自从抗生素被发现以来，在人类疾病治疗过程中发挥了重大的作用，治愈了许多人类束手无策的感染性疾病，挽救了许多人的生命，大大的提高了人类的平均寿命。然而由于它们的大量使用、滥用及不规范使用等原因，致使大量的耐药菌株出现、传播，导致感染性疾病的治疗复杂化，治疗费用增长，发病率、死亡率增加，使得感染菌的耐药性成为一个不可回避的问题。并且这些传统的抗感染药物还具有耳毒性、肾毒性、肝毒性、神经毒性、心脏毒性、变态反应及对造血系统成造成损伤等许多明显的毒副作用，从而对患者造成一些不可预见的影响，甚至会危及患者的生命。由于传统抗生素药物的诸多不利因素，因此寻找抗生素的有效替代品，开发出新的毒性低且效果好的抗菌药物具有现实的意义。而抗菌肽作为一类新型的抗菌药物，近几年来的发展十分迅猛。其中，肺表面活性物质由于是由人体自身细胞所表达、分泌的物质，且可能具有抗炎抗菌活性，因此，以肺表面活性物质为基础开发出一类抗菌药物具有重大前景。肺表面活性蛋白(surfactantprotein，SP)作为肺表面活性物质中最为重要的物质之一，特别是其中的SP-B蛋白的抗菌作用，越来越受到人们的关注。但是，Marnie等研究发现成熟的SP-B蛋白的抗菌作用仅发生于体外，在机体内，成熟SP-B与磷脂质相互关联，磷脂质与SP-B的结合较为稳定，不能使得SP-B作用于外来的细菌来发挥其抗菌功能，并且成熟的SP-B非选择性的作用于磷脂分子层，裂解细胞膜，表现出非选择性的溶解体细胞，特别是红细胞，造成溶血等机体损伤。因此，人们又将目光转移到肺表面活性蛋白B前肽(prosurfactantprotein-B，proSP-B)上，但是，proSP-B由于具有较强的疏水性，很难通过化学合成方式获得，这增加了对该类物质的进一步开发和研究。因此，目前急需寻找一种获得具有良好抗菌活性的proSP-B的方法，以为开发出既可以克服传统抗生素的诸多缺陷，又具有良好抗菌效果的新型抗菌药奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种proSP-B的重组蛋白，编码该重组蛋白的核酸、重组质粒、重组菌株和制备proSP-B的重组蛋白的方法以及它们的应用。采用本专利技术提供的方法，成功地获得了proSP-B重组蛋白，该proSP-B重组蛋白的细胞毒性低，且表现出良好的抗菌活性。为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白，其中，所述重组蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，或者在SEQIDNO：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。第二方面，本专利技术还提供了能够编码上述重组蛋白的核酸。第三方面，本专利技术还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述核酸。第四方面，本专利技术还提供了一种重组菌株，该重组菌株含有上述重组质粒。第五方面，本专利技术还提供了一种制备肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将上述的重组质粒转化至表达宿主菌中，以得到重组菌株；(2)所述重组菌株经培养后，在诱导剂的存在下进行诱导培养，以得到培养液；(3)将由步骤(2)得到的培养液进行纯化和标签去除，以得到肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白。上述重组蛋白、核酸、重组质粒、重组菌株、以及上述的方法制备得到的重组蛋白在制备抗菌药中应用；优选地，所述抗菌药为抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)中的至少一种的药物。proSP-B由于具有较强的疏水性，很难通过化学合成方式获得，本专利技术采用基因工程方法，特别是通过使用特定的表达载体(pGEX4T-1)和表达宿主菌(大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株)，成功地获得了浓度较高的proSP-B重组蛋白，并且，通过将pGEX4T-1载体上的GST标签与proSP-B融合，由于GST标签具有亲水性，可以明显提高proSP-B重组蛋白的水溶性，扩大其应用范围。另外，本专利技术提供的proSP-B重组蛋白表现出良好的广谱抗菌活性，其对临床上常见的细菌、真菌均具有较强的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制活性。进一步的研究发现，proSP-B重组蛋白发挥其抗菌作用的可能是通过影响细菌细胞膜的通透性，从而抑制细菌的正常生长。同时，本专利技术提供的proSP-B重组蛋白的细胞毒性较小，即使将蛋白浓度提高到1mg/mL(该浓度远远大于其对细菌的MIC值)，细胞的增殖能力依然高于59％，这说明本专利技术提供的proSP-B重组蛋白具有较高的安全性。附图说明图1显示的是本专利技术的实施例1中PCR产物鉴定的结果；图2显示的是本专利技术的实施例1中重组质粒pET30-proSP-B的鉴定结果；图3显示的是本专利技术的实施例1中重组质粒pGEX4T-1-proSP-B的鉴定结果；图4显示的是本专利技术的实施例1中proSP-B重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE结果；图5显示的是本专利技术的实施例1中proSP-B重组蛋白诱导表达的Western-blot结果；图6显示的是本专利技术的实施例1中诱导表达的proSP-B重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE和SDS-PAGE；图7显示的是本专利技术的实施例3中proSP-B重组蛋白的抗菌谱测定的结果。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本专利技术提供了一种肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白，其中，所述重组蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，或者在SEQIDNO：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。SEQIDNO：1所示的氨基酸序列为：AGANDLCQECEDIVHLLTKMTKEDAFQDTIRKFLEQECDILPLKLLVPRCRQVLDVYLPLVIDYFQGQIKPKAICSHVGLC。在本专利技术中，所述“连接有标签的氨基酸序列”是指使用本领域常见的标签对SEQIDNO：1所示的氨基酸序列进行添加和修饰。考虑到proSP-B具有较强的疏水性，在优选的情况下，所述标签具有亲水性。更优选地，所述标签为GST标签。在本专利技术中，所述GST(GlutathioneS-transferase，谷胱甘肽S-转移酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，或者在SEQIDNO：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述标签具有亲水性；优选地，所述标签为GST标签。3.一种能够编码权利要求1或2所述的重组蛋白的核酸。4.根据权利要求3所述的核酸，其中，所述核酸具有SEQIDNO：2所示的核酸序列，或者在SEQIDNO：2的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的核酸序列；优选地，所述标签具有亲水性；更优选地，所述标签为GST标签。5.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有权利要求3或4所述的核酸。6.根据权利要求5所述的重组质粒，其中，所述重组质粒为在pGEX4T-1质粒的BamHI和XhoI酶切位点之间插入SEQIDNO：2所示的核酸序列而得到的表达载体。7.一种重组菌株，其特征在于，该重组菌株含有权利要求5或6所述的重组质粒；优选地，所述重组菌株为含有权利要求5或6所述的重组质粒大肠杆菌BL21（DE3）pLysS菌株。8.一种制备肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）将权利要求5或6所述的重组质粒转化至表达宿主菌中，以得到重组菌株；（2）所述重组菌株经培养后，在诱...
【专利技术属性】
技术研发人员：王万能，刘钦，
申请(专利权)人：重庆理工大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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