嵌合蛋白制造技术

本发明专利技术一般地涉及可促进纳米颗粒载体靶向抗原呈递细胞的嵌合蛋白，以及包含这些嵌合蛋白的纳米颗粒载体。所述嵌合蛋白的一个实施方案包含TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)和gp120衍生肽。本发明专利技术还涉及使用包含所述嵌合蛋白的纳米颗粒载体来使抗原在抗原呈递细胞中内化的方法和在对象中引起针对抗原之免疫应答的方法。

Chimeric protein

The present invention generally relates to chimeric proteins that promote nanoparticle carrier targeting antigen presenting cells, and nanoparticle carriers comprising these chimeric proteins. One embodiment of the chimeric protein comprises an TLR5 agonist (e.g., flagellin) and a gp120 derived peptide. The present invention also relates to methods for internalization of antigens in antigen-presenting cells using nanoparticle vectors comprising the chimeric proteins and methods of causing an immune response to antigens in an object.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及可促进纳米颗粒载体与抗原呈递细胞结合并随后被细胞内化的嵌合蛋白，以及包含这些嵌合蛋白的纳米颗粒载体。本专利技术还涉及使用包含嵌合蛋白的纳米颗粒载体，使抗原在抗原呈递细胞中内化的方法和在对象中引起针对抗原之免疫应答的方法。相关申请本申请涉及并要求于2014年10月9日提交的题目为“Chimericproteins”的澳大利亚临时专利申请No.20140904028的优先权。澳大利亚临时专利申请No.20140904028的内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
最佳疫苗设计需要最大免疫原性、安全性和耐受性之间的平衡。现代重组疫苗的改进的安全性特性通常伴随着较低的免疫原性特性。因此，需要增强免疫原性同时保持安全性和耐受性的佐剂和新的递送系统。专利技术概述在一方面，本专利技术涉及包含第一多肽和第二多肽的嵌合蛋白，其中所述第一多肽是Toll样受体5(TollLikeReceptor5，TLR5)激动剂；并且所述第二多肽与SEQIDNO：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性和至少8个N-糖基化位点。在一些实施方案中，TLR5激动剂是鞭毛蛋白多肽、抗TLR5抗体或抗TLR5适配体。例如，TLR5激动剂可以是选自以下的鞭毛蛋白多肽：沙门菌属(Salmonellaspp)、埃希菌属(Escherichiaspp)、疏螺旋体属(Borreliaspp)、螺杆菌属(Helicobacterspp)、弯曲菌属(Campylobacterspp)、柄杆菌属(Caulobacterspp)、弧菌属(Vibriospp)、芽孢杆菌属(Bacillusspp)、假单胞菌属(Pseudomonasspp)、根瘤菌属(Rhizobiumspp)、盐杆菌属(Halobacteriumspp)、富盐菌属(Haloferaxspp)、梭菌属(Clostridiumspp)、肠杆菌属(Enterobacterspp)、欧文菌属(Erwiniaspp)、克雷伯菌属(Klebsiellaspp)、耶尔森菌属(Yersiniaspp)、变形杆菌属(Proteusspp)、沙雷菌属(Serratiaspp)、希瓦菌(Shewanellaspp)、志贺菌属(Shigellaspp)和链霉菌属(Streptomycesspp)的鞭毛蛋白。在一个特别的实例中，鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：2所示序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，第二多肽与SEQIDNO：1所示gp120多肽具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，第一多肽的C末端与第二多肽的N末端相连接。在另一个实施方案中，第一多肽的N末端与第二多肽的C末端相连接。在本专利技术的另一些实施方案中，嵌合蛋白还可包含标签，例如组氨酸标签。在一个特别的实施方案中，TLR5激动剂是鞭毛蛋白多肽，并且与gp120多肽相连接。在另一个实施方案中，嵌合蛋白与SEQIDNO：5所示多肽具有至少90％的序列同一性。在本专利技术的一个实施方案中，嵌合蛋白是糖基化的。例如，嵌合蛋白可包含昆虫细胞糖基化模式。在另一方面，本专利技术涉及核酸分子，其编码上述和本文中所述的嵌合蛋白。本专利技术的另一方面涉及纳米颗粒载体，其包含上述和本文中所述的嵌合蛋白。在一个实施方案中，纳米颗粒载体包含至少一种另外的TLR激动剂，例如Pam3Cys、Pam2Cys、MALP2、MPLA、三酰化脂肽、细菌肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、脂多糖、GPI-锚蛋白、奈瑟菌孔蛋白(Neisserialporin)、磷脂甘露聚糖(phospholipomannan)、CFA、FSL-1、Hib-OMPC、RSVF蛋白、糖肌醇磷脂(glycoinositolphospholipid)、Hsp60、Hsp70、纤连蛋白结构域A、表面活性蛋白A、透明质酸(hyaluronan)、HMGB-1、AGP、RC-529、MDF2β、酚可溶性调控蛋白(phenol-solublemodulin)、二酰化脂肽、LTA、酵母聚糖、咪唑并喹啉、洛索立宾(loxoribine)和疟原虫色素(hemozoin)。在一些实施方案中，嵌合蛋白通过螯合作用附接于纳米颗粒载体的表面。例如，嵌合蛋白可包含组氨酸标签，并且纳米颗粒载体可包含氨三乙酸部分(nitrilotriaceticacidmoiety)，并且嵌合蛋白通过组氨酸标签、氨三乙酸部分和金属离子之间的螯合作用附接于纳米颗粒载体。在一些实例中，氨三乙酸部分是氨三乙酸(nitrilotriaceticacid，NTA)或三氨三乙酸(trinitrilotriaceticacid，3NTA)。在一个实施方案中，氨三乙酸部分附接于至少一个脂族链。在一些特别的实例中，氨三乙酸部分附接于二(十四烷基)胺(ditetradecylamine，DTDA)、Pam2Cys或Pam3Cys。在一个实施方案中，纳米颗粒载体包含氨三乙酸-二(十四烷基)胺(NTA-DTDA)或3(氨三乙酸)-二(十四烷基)胺(3NTADTDA)或Pam2CysSerLys8Cys-3NTA。在一些实施方案中，纳米颗粒载体选自脂质体、病毒微体、病毒样颗粒、古细菌脂质体(archaeosome)、质膜囊泡、非离子表面活性剂囊泡(niosome)、脂质核心肽、免疫刺激复合物和基于聚合物的纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒载体还包含抗原。在一些实例中，抗原附接于纳米颗粒载体的表面。在另一些实例中，抗原包封在纳米颗粒载体内。在另一些方面，本专利技术涉及在对象中引起针对抗原之免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用包含上述和本文中所述的嵌合蛋白和抗原的纳米颗粒载体。在一些实施方案中，免疫应答包括CD8+T细胞应答。在另一些实施方案中，免疫应答包含CD4+T细胞应答和抗体应答。在另一方面，本专利技术涉及使抗原在抗原呈递细胞中内化的方法，所述方法包括使抗原呈递细胞与包含上述和本文中所述的嵌合蛋白和抗原的纳米颗粒载体接触。在一些特别的实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。附图简述图1示出了Fg115嵌合蛋白。(A)Fg115表达盒的核苷酸序列。(B)Fg115嵌合蛋白的氨基酸序列。(C)Fg115嵌合蛋白的示意图，示出了潜在N-糖基化位点。(D)在Sf9细胞中表达的经纯化Fg115嵌合蛋白的SDS-PAGE分析，示出了合并峰A(泳道2)和峰B(泳道3)级分，以及泳道1中分子量标记。图2示出了用接枝有Fg115、FlgT或DMS5000抗体的脂质体或者未接枝脂质体培养的人单核细胞衍生树突细胞(monocyte-deriveddendriticcell，moDC)的FAC分析。图3示出了评估人moDC对Fg115接枝脂质体内化的两个研究的结果。将Fg115、DMS5000接枝的脂质体或者未接枝脂质体与人moDC在4℃或37℃下培养。然后用PBS或PBS/咪唑洗涤细胞-脂质体混合物，并通过FACS进行分析。示出了反映来自第一供体(A)和第二供体(B)的内化脂质体的MFI。图4示出了用来自DC-SIGN转基因小鼠(DC-SIGNTg)的CD11c+细胞孵育的OT-I细胞的FAC分析的结果，所述CD11c+细胞已经用负载有高水平OVA(LipOVA(高)：100μg本文档来自技高网...

【技术保护点】
嵌合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，其中：所述第一多肽是Toll样受体5(TLR5)激动剂；并且所述第二多肽与SEQ ID NO：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性并且具有至少8个N‑糖基化位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.09 AU 20149040281.嵌合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，其中：所述第一多肽是Toll样受体5(TLR5)激动剂；并且所述第二多肽与SEQIDNO：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性并且具有至少8个N-糖基化位点。2.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述TLR5激动剂是鞭毛蛋白多肽、抗TLR5抗体或抗TLR5适配体。3.权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述鞭毛蛋白多肽选自：沙门菌属(Salmonellaspp)、埃希菌属(Escherichiaspp)、疏螺旋体属(Borreliaspp)、螺杆菌属(Helicobacterspp)、弯曲菌属(Campylobacterspp)、柄杆菌属(Caulobacterspp)、弧菌属(Vibriospp)、芽孢杆菌属(Bacillusspp)、假单胞菌属(Pseudomonasspp)、根瘤菌属(Rhizobiumspp)、盐杆菌属(Halobacteriumspp)、富盐菌属(Haloferaxspp)、梭菌属(Clostridiumspp)、肠杆菌属(Enterobacterspp)、欧文菌属(Erwiniaspp)、克雷伯菌属(Klebsiellaspp)、耶尔森菌属(Yersiniaspp)、变形杆菌属(Proteusspp)、沙雷菌属(Serratiaspp)、希瓦菌属(Shewanellaspp)、志贺菌属(Shigellaspp)和链霉菌属(Streptomycesspp)的鞭毛蛋白。4.权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：3所示序列具有至少90％的序列同一性。5.权利要求1至4中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述第二多肽与SEQIDNO：1所示gp120多肽具有至少90％的序列同一性。6.权利要求1至5中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述第一多肽的C末端与所述第二多肽的N末端相连接。7.权利要求1至5中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述第一多肽的N末端与所述第二多肽的C末端相连接。8.权利要求1至7中任一项所述的嵌合蛋白，其还包含标签。9.权利要求8所述的嵌合蛋白，其中所述标签是组氨酸标签。10.权利要求1至9中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述TLR5激动剂是鞭毛蛋白多肽，并且与gp120多肽相连接。11.权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白与SEQIDNO：5所示多肽具有至少90％的序列同一性。12.权利要求1至11中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白是糖基化的。13.权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含昆虫细胞糖基化模式。14.核酸分子，其编码根据权利要求1至13中任一项所述的嵌合蛋白。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹森·大卫·普赖斯，克里斯托弗·帕里什，伊内斯·阿特莫苏卡托，
申请(专利权)人：利普泰克有限公司，澳大利亚国立大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU