【技术实现步骤摘要】
双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法。
技术介绍
副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15%，死亡率可达50%以上，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn (KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为15个血清型，另有20%以上的分离株血清型不可定。己有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征，基于某个或某些特定血清型菌株的全菌体制备的灭活疫苗在不同血清型之间所产生的交叉保护率很低，急待研制具有高效交叉保护力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是当前多数传染病的研究热点。目前关于Hps的致病机理尚不清楚，aroA基因和omp2基因被认为是Hps的潜在毒力基因，在其它细菌中有较深的研究报道。aroA基因是细菌芳香族氨基酸代谢通路中一个非常重要的酶，该酶活性的缺失会导致细菌毒力降低等生物学变化，已被应用于多种细菌的缺失...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于:其是菌株的aroA基因缺失第394131- 394631核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为:CCTCC NO: M2013460。2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于，其步骤如下: A)基因的克隆与重组自杀性质粒的构建:参照GenBank中aroA、omp2基因的序列，从HlO中扩增了 aroA和omp2基因的上下游片段；将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEM0C2上，构建缺失第394131- 394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEM AaroA和缺失第181258- 181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒ρΕΜ Δ omp2 ； B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:以转化了上述重组自杀性质粒ρΕΜ Δ aroA的大肠杆菌β 2155为供体菌，血清5型菌株HlO为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建出aroA基因缺失第394131- 394631位核苷酸的单基因缺失株HS02 ； C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建:用转化了上述重组自杀性质粒ρΕΜΔοπιρ2的大肠杆菌β 2155为供体菌，上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使`第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建构建aroA基因缺失第394131- 394631位基因和omp2基因缺失181258- 181643双基因缺失的菌株。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于:步骤B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中，第一次PCR鉴定时，所用的上游引物为SEQ ID N0:5，下游引物为SEQ ID N0:6 ;第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID NO: 7，下游引物为SEQ ID N0:8。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中，第一次PCR鉴定时，上游引物为SEQ ID N0:9，下游引物为SEQ ID NO: 10，第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID N0:7，下游引物为SEQ ID N0:8。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述基因的克隆与重组自杀性质粒的构建具体步骤如下: DHps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌接种于TSB振摇培养过夜；再取菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板，于37°C培养箱倒置培养过夜；取上述菌液至EP管中，离心后弃上清，倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分；沉淀重悬于TE中，加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小时；加入NaCl溶液、10% SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K，48-52°C水浴中作用2_4h ;用枪头将混合液均分到两个新的EP管中，加入与菌液等体积的酚、氯仿以及异戊醇的混合液抽提两次；抽提后用异丙醇于-15°C以下的冰箱中沉淀，离心后弃上清，用预冷的乙醇洗涤两次；室温干燥后，用含20mg/mLRNAase的TE溶解DNA，用于PCR反应中作模板； ，2 )核酸物质的胶回收纯化:上述D NA注入琼脂糖凝胶的梳空内，放入电泳槽中电泳15-20min ;在紫外灯下切下所需的目的片段，然后放入离心管中，加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化；将DNA-琼脂糖溶液转移到HiBindDNA柱子中，并把HiBindDNA柱子装入收集管内，室温下离心处理，弃去滤液；将空柱子重新套回收集管中，离心甩干柱子中残余的液体；把柱子装在离心管上，加入洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上，离心后得到的溶液即纯化的DNA产物； ，3)大肠杆菌感受态细胞的制备:采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞； ，4)连接产物的转化:将上述大肠杆菌感受态细胞加入纯化的DNA产物，轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴后于37-45°C的水浴中热激后；快速转移到冰浴中，使细胞冷却；加入SOC培养基，于摇床上摇动细胞使细菌复壮；取复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上，待液体被完全吸干之后于35-42°C倒置培养； ，5)质粒的制备:将步骤4)中导致培养后的肠杆菌接种于含有抗生素的液体培养基中，摇床中振摇培养；将菌液分装到...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾爱卿，王贵平，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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