【技术实现步骤摘要】
新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体及其制备方法。
技术介绍
含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)—起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(R0S)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。小分子模拟物主要有PZ51 (ebSelen)、AL3823A、BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID No: 1、SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 或 SEQ ID No:4 所示。2.如权利要求1所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:是在SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的GPX突变体。3.如权利要求2所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7 或 SEQ ID No:8 所示。4.如权利要求1所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:是将SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No: 3或SEQ ID No:4所示氨基酸序列中靶基因的任何一个或多个丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser所形成的GPX突变体。5.如权利要求3所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:是将SEQ ID No: 5、SEQ ID No:6、SEQ ID No: 7或SEQ ID No:8所示氨基酸序列中靶基因的任何一个或多个丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser所形成的GPX突变体。6.如权利要求4或5所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID No:9、SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12、SEQ IDNo: 13、SEQ ID No: 14、SEQ ID No: 15、SEQ ID No: 16 或 SEQ ID No: 17 ~38 所示。7.权利要求1所述的一种新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体的制备方法，其步骤如下: 1)、表达载体的构建:根据本发明所述GPX突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX突变体蛋白的基因，确保靶基因的5'端含有起始密码子ATG，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子，且基因全长不含有ACA序列；具体的基因序列是将GPXl基因中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丙氨酸的密码子，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子，并根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因，也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX突变体蛋白，且全长不含有ACA序列的编码基因；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列； 2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化: 用步骤I)中构建的含有GPX突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4_25°C诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX突变体蛋白，透析冻干后即得GPX突变体蛋白纯品； 所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX突变体蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白； 所述的将液体低温离心，是在4°C、8000-12000g离心15_30min ； 或， 1)、表达载体的构建: 根据基因文库中公开的GPX1、GPX2、GPX3或GPX4的基因序列设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5'端含有起始密码子ATG，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保引物中编码Cys的密码子替换成Ala的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX中要突变为半胱氨酸的唯一硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变成半胱氨酸的密码子；同理，用上述定点突变的方法在确保不引入ACA序列的前提下，将GPX基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丙氨酸的密码子，再根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将GPX基因中所有ACA序列突变掉；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPX突变体蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列； 2)、阳性转化子的筛选及突变体蛋白的表达与纯化 用步骤I)中构建的含有GPX突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷低温4-25°C诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的重组GPX突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里,而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得含GPX突变体的上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化，透析冻干后即得酶蛋白纯品； 所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX突变体，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白； 所述的将液体低温离心， 是在4°C，8000-12000g离心15_30min ； 或，1)、表达载体的构建: 根据本发明所述GPX突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX突变体蛋白的基因，确保靶基因的5'端含有起始密码子ATG，.3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子；具体的基因序列是将GPXl基因中第2、.78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丙氨酸的密码子，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子所得到的编码基因，也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX突变体蛋白的编码基因；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有而GPX突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列； 2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化: 用步骤I)中构建的含有GPX突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷诱导，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗漆、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX突变体蛋白，透析冻干后即得GPX突变体蛋白纯品； 所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX突变体蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白； 所述的将液体低温离心，是在4°C，8000-12000g离心15_30min ； 或， 1)、表达载体的构建: 根据基因文库中公开的GPX1、GPX2、GPX3或GPX4的基因序列设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5'端含有起始密码子ATG，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保引物中编码Cys的密码子替换成Ala的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX中要突变为半胱氨酸Cys的唯一 SeCys和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp ;用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX基因中的SeCys的编码序列突变成Cys的密码子；同理，用上述定点突变的方法将GPX基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丙氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPX突变体蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性 核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化: 用步骤I)中构建的含有GPX突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷诱导，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集...
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