适用于FFPE 样品的基因表达定量的实时定量PCR 方法技术

本发明专利技术涉及核酸分子定量的方法，具体而言，涉及适用于石蜡组织切片(FFPE)样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，该方法包括1)反转录反应阶段；2)预扩增反应阶段；和3)巢式内扩增qPCR反应阶段。与传统的反转录qPCR相比，本发明专利技术的方法即保证了反转录、qPCR反应的特异性，又降低了反应所需底物的浓度，可以使qPCR的检测灵敏度提高500倍以上，尤其适用于低质量和/或低浓度的石蜡组织切片提取的mRNA的定量检测。本发明专利技术的方法可以极大地提高此类检测的灵敏度和可靠度。

Quantitative real-time PCR method for quantitative gene expression in FFPE samples

The invention relates to a method for quantitative nucleic acid molecules specifically relates to suitable for paraffin sections (FFPE) samples gene expression by quantitative real-time PCR quantitative method, the method includes: 1) reverse transcription reaction stage; 2) pre amplification stage; and 3) in the nested amplification of qPCR reaction stage. Compared with the traditional reverse transcription qPCR, the method of the invention is to ensure the specificity of reverse transcription, qPCR reaction, and reduce the concentration required for the reaction substrate, can make the detection sensitivity of qPCR increased more than 500 times, especially suitable for the quantitative detection of low quality and / or low concentration of paraffin slice extraction mRNA. The method of the invention can greatly improve the sensitivity and reliability of such detection.

【技术实现步骤摘要】
适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法
本专利技术涉及核酸分子定量的方法，具体而言，涉及适用于石蜡组织切片(FFPE)样品的基因表达定量的实时定量PCR方法。
技术介绍
基因表达调控水平的定量经常用于医学诊断和生理、生物学通路功能研究。特定基因表达水平的变化可以作为某些疾病诊断的分子信号，一些疾病预后诊断方法，如乳腺癌远端复发预测诊断(OncotypeDX)，依据16个癌症相关的基因和5个管家基因的表达水平，确定乳腺癌术后远端复发风险。由于诊断方案检测的样本对象为福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。福尔马林固定-石蜡切片的组织样本是临床上病理分析最为常见的样品，但其在制备过程中，mRNA的完整度会遭到破坏。另外，polyA结构也会大量降解，造成反转录反应的低效率甚至反应失败。而且因为石蜡切片中目的细胞(如癌变细胞)的含量往往非常少，给基于此类样品基因表达水平检测的诊断方法造成困难。目前对于基因表达水平的检测最常用的技术平台为反转录实时定量PCR(RT-qPCR)方法，例如OncotypeDX乳腺癌远端复发预后诊断等。qPCR对基因表达水平的定量采用最广泛的是相对定量法，在基因水平上测量目标基因和参照基因的相对表达差异(deltaCT法)；在生物学水平上测量基因相对表达在不同样品间的差异(delta-deltaCT法)反转录实时定量PCR方法在实验上分为两步法和一步法。两步法RT-qPCR将反转录反应和qPCR反应分开。第一步反转录反应常以多重T引物(polyT)或者6碱基随机短片段作为通用反转录引物进行转录反应。反转录反应的产物经过稀释(或者原液)再进行采用基因特异性引物扩增的第二步qPCR反应。两步法RT-PCR的优点是反应体系简单，采用通用引物进行多基因同时反转录，避免了不同的反转录引物反转录效率偏好性的缺点。但也有明显的不足，如通用引物针对某个基因的反转录引物有效浓度不高导致的反转录效率低下，或者样品降解严重时反转录引物失效等等。而传统的一步法RT-qPCR将反转录反应和PCR反应置于一个反应体系中，其中PCR的3'端引物同时作为基因特异性反转录引物和qPCR引物。在同一反应体系下先后进行反转录和PCR反应，传统一步法qPCR的优点是采用基因特异性引物作为反转录引物，大大提高了针对目标基因的反转录引物浓度。但其缺点也非常明显，亦即其反转录引物和PCR反应引物为同一个片段，其退火温度设置为PCR的退火温度，大大高于反转录酶耐受的反转录温度，在远低于引物的标准退火温度条件下，会造成大量的非特异性反转录，而这些非特异性反转录产物因其含有PCR引物匹配序列，也会在下一步的PCR反应中造成干扰。另外因为引物的设计是针对PCR反应的，其引物浓度和退火温度并未考虑反转录反应的优化。基因特异性反转录引物在统一反转录条件下会表现出不同反转录效率，这也会造成下一步qPCR对不同基因定量表达造成较大系统误差，造成检测和诊断的不准确。为了提高针对福尔马林固定、石蜡包埋组织切片等低质量或者/和少量mRNART-qPCR定量的灵敏性和准确度,已经有部分工作如提高RNA提取质量和改善试剂(采用更高温度耐受的反转录酶)等，这些方法对于所述目的贡献度有限，不能达到实际的目的和要求。为改善RT-qPCR的灵敏度和稳定性，更为有效的策略是提高反转录及PCR扩增的效率。目前针对提高RNA反转录效率，尤其是极少量并且\或者质量不高的RNA的策略之一为在反转录时，一端或者两端引入接头序列，先用接头引物进行预扩增，然后用基因特异性引物进行巢式扩增，如Clontech的cDNA合成试剂盒(PCRcDNASynthesisKit)，极大地提高了目标基因片段扩增的灵敏度。但这种策略仅仅适用于定性性质的PCR，其目的为获得足够量的目的片段，不能有效的限制非特异性产物的扩增，切胶回收是其获得特异性扩增产物的必要步骤。因此这一策略在实时定量PCR中并没有实用性。但其基本策略为改善RT-qPCR的反应效率具体策略提供了一种思路。又如为提高实时定量PCR的灵敏度，已经有相关专利和文献将巢式反应引入定量PCR(如PCRMethodsAppl.1994Jun；3(6):332-7；Journalofmicrobiologicalmethods102(2014):15-22),采用基因特异性的两对引物以提高实时定量PCR的灵敏度。为保证巢式反应的反应效率和特异性，巢式定量PCR的内外引物的退火温度和浓度比例必须经过严格设计和优化，实际实施难度较大。
技术实现思路
本专利技术改进了RT-qPCR的反转录系统，采用全新的qPCR扩增策略，并且可将全部反应集成在一个反应体系中，在应用与低质量和/或者少量的石蜡组织来源的mRNA表达水平检测时，其灵敏度有了大幅度提高。本专利技术针对常规实时定量PCR在检测长期保存的石蜡组织切片样本的mRNA表达水平时检测灵敏度不够的问题，设计实施了一种基于不同的反转录和PCR扩增的策略，其反应步骤包括：具有保护性颈环结构的多重转录引物实现的反转录反应；由5’端基因特异性引物和3’端通用外扩增引物实现的外扩增反应；和由5’端基因特异性引物和3’端基因特异性引物实现的巢式内扩增qPCR反应。与传统的反转录qPCR相比，本专利技术的方法即保证了反转录、qPCR反应的特异性，又降低了反应所需底物的浓度，可以使qPCR的检测灵敏度提高500倍以上，尤其适用于低质量和/或低浓度的石蜡组织切片提取的mRNA的定量检测。本专利技术的方法可以极大地提高此类检测的灵敏度和可靠度。因此，本专利技术提供了一种新的实时定量PCR方法。应用本方法可以极大地提升实时定量PCR的检测灵敏度等，尤其适用于降解较为严重和/或样本量较少的石蜡组织切片提取RNA。根据本专利技术的实时定量PCR方法是特别适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，其反应步骤可以分为三个阶段：1)反转录阶段；2)预扩增阶段；3)巢式内扩增qPCR阶段。特别是，所有反应可以均在一个反应体系中进行。具体反应步骤阐述如下：1)反转录反应：使用待检测的mRNA(特别是来自FFPE样品的mRNA)片段作为模板，通过反转录引物，在反转录酶的作用下自模板的3'端向5'端进行延伸反应合成5‘端具有稳定的茎-环结构的第一链cDNA，其中，所述反转录引物是具有热稳定的茎-环结构的DNA单链，该茎-环结构由三个结构区域构成：i)3'端特异性底物结合区域，其可以匹配结合在底物mRNA上的退火区域，优选由8-15个碱基构成，更优选由10-12个碱基构成；ii)茎结构区域，其为由两个碱基数目和碱基序列完全互补匹配的DNA序列构成的双链稳定结构，优选由6-12个碱基构成；和iii)环结构区域，其序列位于形成茎结构的两段DNA序列之间，优选由18-25个碱基构成，其不与i)区域和ii)区域形成任何形式的稳定的匹配双链结构。此外，当涉及多个针对同一待检测的mRNA的反转录引物时，这些反转录引物除3‘端特异性底物结合区域不同外，具有相同的茎-环结构区域序列。2)外扩增PCR反应：以反转录反应获得的第一链cDNA为模板，通过5'端基因特异性引物和3'端通用外扩增引物，在DNA聚合酶作用下进行扩增反应以得到外扩增产物(其产物为双链本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实时定量PCR方法，特别是适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，包括：1)反转录反应：使用待检测的mRNA(特别是来自FFPE样品的mRNA)片段作为模板，通过反转录引物，在反转录酶的作用下自模板的3'端向5'端进行延伸反应合成5‘端具有稳定的茎‑环结构的第一链cDNA，其中，所述反转录引物是具有热稳定的茎‑环结构的DNA单链，该茎‑环结构由三个结构区域构成：i)3'端特异性底物结合区域，其可以匹配结合在底物mRNA上的退火区域，优选由8‑15个碱基构成，更优选由10‑12个碱基构成；ii)茎结构区域，其为由两个碱基数目和碱基序列完全互补匹配的DNA序列构成的双链稳定结构，优选由6‑12个碱基构成；和iii)环结构区域，其序列位于形成茎结构的两段DNA序列之间，优选由18‑25个碱基构成，其不与i)区域和ii)区域形成任何形式的稳定的匹配双链结构；2)外扩增PCR反应：以反转录反应获得的第一链cDNA为模板，通过5'端基因特异性引物和3'端通用外扩增引物，在DNA聚合酶作用下进行扩增反应以得到外扩增产物，其中，所述5'端基因特异性引物与第一链cDNA的3'端相匹配，同时也是下一步巢式内扩增qPCR反应的5'端基因特异性引物；所述3'端通用外扩增引物的序列与步骤1)中反转录引物的环结构区域一致；3)巢式内扩增qPCR反应：以5'端基因特异性引物和3'端基因特异性引物为扩增引物，以外扩增产物为模板，在DNA聚合酶作用下进行内扩增PCR反应，其中，所述5'端基因特异性引物与步骤2)中的5'端基因特异性引物相同，所述3'端基因特异性引物位于外扩增PCR 3‘端通用引物的下游，基因特异性匹配底物序列。...

【技术特征摘要】
1.一种实时定量PCR方法，特别是适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，包括：1)反转录反应：使用待检测的mRNA(特别是来自FFPE样品的mRNA)片段作为模板，通过反转录引物，在反转录酶的作用下自模板的3'端向5'端进行延伸反应合成5‘端具有稳定的茎-环结构的第一链cDNA，其中，所述反转录引物是具有热稳定的茎-环结构的DNA单链，该茎-环结构由三个结构区域构成：i)3'端特异性底物结合区域，其可以匹配结合在底物mRNA上的退火区域，优选由8-15个碱基构成，更优选由10-12个碱基构成；ii)茎结构区域，其为由两个碱基数目和碱基序列完全互补匹配的DNA序列构成的双链稳定结构，优选由6-12个碱基构成；和iii)环结构区域，其序列位于形成茎结构的两段DNA序列之间，优选由18-25个碱基构成，其不与i)区域和ii)区域形成任何形式的稳定的匹配双链结构；2)外扩增PCR反应：以反转录反应获得的第一链cDNA为模板，通过5'端基因特异性引物和3'端通用外扩增引物，在DNA聚合酶作用下进行扩增反应以得到外扩增产物，其中，所述5'端基因特异性引物与第一链cDNA的3'端相匹配，同时也是下一步巢式内扩增qPCR反应的5'端基因特异性引物；所述3'端通用外扩增引物的序列与步骤1)中反转录引物的环结构区域一致；3)巢式内扩增qPCR反应：以5'端基因特异性引物和3'端基因特异性引物为扩增引物，以外扩增产物为模板，在DNA聚合酶作用下进行内扩增PCR反应，其中，所述5'端基因特异性引物与步骤2)中的5'端基因特异性引物相同，所述3'端基因特异性引物位于外扩增PCR3‘端通用引物的下游，基因特异性匹配底物序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中，当涉及多个针对同一待检测的mRNA的反转录引物时，这些反转录引物除3‘端特异性底物结合区域不同外，具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金银，庞震国，白山，刘琦，李杰，许立志，于闯，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21