The invention discloses an improved two generation sequencing method of making joint with random label, which is characterized in that: the introduction of Spacer modified to prevent the polymerase extension in joint P7 joint on the primer extension step; in the joint, Spacer met P7 template site polymerase chain after termination of extension, leaving a 5 'protruding end the next step; restriction endonuclease, Spacer locus, including removal of protruding ends, resulting in complete digestion and joint; inadequate residue has not been digested joints, still retain longer 5' protruding end.
【技术实现步骤摘要】
一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法
本专利技术涉及核酸测序
,具体涉及一种用于改进的二代测序用随机标签接头的工艺优化。
技术介绍
随着技术的成熟以及成本的降低,二代测序因其测序通量上的优势,在科研以及临床转化领域正在逐渐取代传统的一代测序以及常规的PCR分子检测方法。二代测序应用于临床目前还面临许多问题与挑战,其中一个突出问题就是测序较高的错误率。目前应用较广的二代测序平台主要有Illumina平台(HiSeq、MiSeq、NextSeq等)和Life的IonTorrent平台(PGM和Proton及衍生系列),两类二代测序的的测序错误率还较高(Illumina平台0.1%,IonTorrent平台1%)。对于以肿瘤细胞突变为代表的体细胞突变(somaticmutation)检测来讲,由于肿瘤细胞之间的异质性,肿瘤样本中突变位点的比例可能非常低(1%);而在液态活检中,肿瘤游离DNA的突变率甚至低于0.1%。由于较高的测序错误率背景,常规的二代测序平台无法检测出这些突变。目前主要通过分子标签(UMIuniquemoueculeidentifier)的方法来克服这一问题。分子标签是一小段DNA片段,可以是固定序列的组合,也可以是随机序列,在测序前的文库制备阶段,通过给每一条原始DNA模板上引入分子标签标记,来达到区分DNA模板的目的;在后续的生物信息学分析阶段,通过分子标签的识别,就可以利用文库构建过程中产生的重复序列(duplication)来实现测序碱基的校正的目的。分子标签技术主要包括PCR法和随机标签接头法,随机标签接头法由于更低的错误率 ...
【技术保护点】
一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法,其特征在于:在接头制作的接头引物P7上引入能够阻止聚合酶延伸的Spacer修饰;在接头延伸步骤,聚合酶遇到P7模板链的Spacer位点后即终止延伸,留下一段5’突出末端;接下来的酶切步骤,内切酶去除包括Spacer位点在内的突出末端,产生完整的接头;而酶切不充分残留的未被酶切接头,仍然保留较长5’突出末端。
【技术特征摘要】
1.一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法,其特征在于:在接头制作的接头引物P7上引入能够阻止聚合酶延伸的Spacer修饰;在接头延伸步骤,聚合酶遇到P7模板链的Spacer位点后即终止延伸,留下一段5’突出末端;接下来的酶切步骤,内切酶去除包括Spacer位点在内的突出末端,产生完整的接头;而酶切不充分残留的未被酶切接头,仍然保留较长5’突出末端。2.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法,其特征在于:Spacer修饰的种类包括dSpacer,C3Spacer,C6Spacer,C12Spacer,Spacer9或Spacer18等。3.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法,其特征在于:Spacer修饰的个数为1个-5个;2个以上的Spacer跟第一个Spacer串联,或分布于突出末端序列中。4.如权利要求1所述的一种改进的二代测序用随机标签接头制作方法,其特征在于:随机标签接头包括随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C,随机标签接头A、随机标签接头B和随机标签接头C分别由接头引物P5分别与Spacer修饰的接头引物P7-A、接头引物P7-B和接头引物P7-C合成而得到,其中:接头引物P5为SEQIDNO:01:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT接头引物P7-A为FFFFF(Spacer)EEEEEJJJJJNNNNNNNNNNNN连接在SEQIDNO:02的5’端所得;SEQIDNO:02:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC接头引物P7-B为FFFFF(Spacer)EEEEEKKKKKNNNNNNNNNNNN连接在SEQIDNO:02的5’端所得;接头引物P7-C为FFFFF(Spacer)EEEEELLLLLNNNNNNNNNNNN连接在SEQIDNO:02的5’端所得;所述FFFFF为突出末端序列,Spacer为Spacer修饰位点,EE...
【专利技术属性】
技术研发人员:金保雷,李旭超,施伟杰,葛会娟,阮力,郑立谋,
申请(专利权)人:厦门艾德生物医药科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:福建,35
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