一种天然利那洛肽的结晶方法技术

本发明专利技术涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备技术领域。包括：以树脂作为固相载体，依照固相多肽合成的方法依次缩合具有N‑芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D型氨基酸；待氨基酸缩合结束后，使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离，通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽，再通过高效液相色谱分离、冻干，得到纯化后的还原态利那洛肽；最后，通过复性折叠实现二硫键的正确配对，即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽；添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中，充分混匀后，通过运用蛋白结晶筛选方法，采用不同的结晶溶液、特定温度及时间，实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。

Crystallization method of natural tigecycline.

The invention relates to a method for the crystallization of natural linaclotide, which belongs to the technical field of medicine preparation. Including: with resin as solid carrier, in accordance with the method of solid phase peptide synthesis, followed by condensation with N 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) type D protected amino acids; for amino acid condensation after the use of the side chain protecting groups removal and separation of peptides and resin cutting fluid through the ether sedimentation crude peptide cutting fluid image Linaro peptides, by HPLC and lyophilized purified peptide reduced Linaro; finally, through the complex folding to achieve two correct pairing of disulfide bonds can be obtained with the correct image Linaro peptide spatial configuration; neutral buffer add mirror Linaro to the natural peptide peptide of Linaro in full mixing, through the use of protein crystallization screening method, the crystallization solution, different specific temperature and time, to achieve image Linaro assisted natural peptide The crystallization of tigecycline.

【技术实现步骤摘要】
一种天然利那洛肽的结晶方法
本专利技术涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备

技术介绍
利那洛肽(Linaclotide)由14个氨基酸组成，其氨基酸序列为CCEYCCNPACTGCY，其中的第1位与第6位半胱氨酸、第2位与第10位半胱氨酸和第5位与第13位半胱氨酸分别形成二硫键，三对二硫键发挥着稳定其空间构型的作用。利那洛肽是鸟苷酸环化酶C(以下简称GC-C)的激动剂，可以通过结合肠道上皮的GC-C受体进而促进肠道内液体分泌的增多以及肠道蠕动的增加，也有助于降低痛觉神经的灵敏度。2012年美国FDA批准了利那洛肽(商品名：Linzess；公司：Ironwood)用于治疗成人的慢性特发性便秘(CIC)及便秘型肠易激综合征(IBS-C)。以疾病相关的蛋白/多肽三维空间结构为基础进行药物设计与筛选的方法，具有目标明确，开发周期短的优点。因此，获得蛋白/多肽晶体具有重要意义。专利(WO2010/059733A；WO2014/118180A)报道了在酸性溶液或有机溶剂的条件下，获得利那洛肽晶体的方法。该方法结晶条件较为苛刻，难于操作。因此本领域中仍然需要简单高效的方法来获得利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：(1‑1)在树脂中加入N,N‑二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N‑二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；(1‑2)以步骤(1‑1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N‑芴甲氧羰基‑O‑叔丁基‑D‑酪氨酸溶于5毫升的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N‑二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1‑1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为...

【技术特征摘要】
1.一种天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；(1-3)将4倍量的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的N,N-二异丙基乙胺,充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸；(1-5)向步骤(1-4)中的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘磊，陈晨晨，高帅，李宜明，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11