本发明专利技术公开了一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM及其应用。一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。多肽PDBCM能够增加BIRC6表达、降低凋亡蛋白Smac和caspase‑9表达，从而促进囊胚形成。所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM可在制备促进囊胚形成和/或提高囊胚质量的药物或制备体外受精‑胚胎移植过程中囊胚培养液中应用。
Embryonic secretory endogenous polypeptide PDBCM and uses thereof
The invention discloses an embryonic secretory endogenous polypeptide PDBCM and the application thereof. An embryo secreted endogenous polypeptide PDBCM, the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The PDBCM can increase the expression of BIRC6, Smac and caspase reduced apoptosis protein 9 expression, thereby promoting blastocyst formation. The embryo secreted endogenous polypeptide in the preparation of PDBCM can promote blastocyst formation and / or improve the quality of blastocysts drug or preparation liquid in the application of blastocyst culture in vitro fertilization embryo transfer in.
【技术实现步骤摘要】
一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM及其应用
本专利技术属于辅助生殖领域，涉及一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM及其应用。
技术介绍
常规体外受精-胚胎移植技术经过30多年的发展和改善，从技术上解决了不孕不育等长期困惑的医学难题，然而体外受精-胚胎移植常规治疗中，为了保证一定的临床妊娠率，实行2-3枚卵裂期胚胎移植已是惯例。因此，近30年来人群总体双胎妊娠率增加了50％-70％，三胎妊娠率增加了400％，而多胎妊娠已严重威胁了母婴安全，近年来母体妊娠期并发症上升了3-7倍，新生儿死亡率及发病率上升了4-10倍，大大增加患者及社会的经济负担。因此提高IVF临床妊娠率的同时又能避免多胎妊娠的问题一直是世界各国辅助生殖工作者共同面临的挑战。多年研究表明，规避多胎妊娠风险又能保证临床妊娠率最公认有效的方法就是实行单囊胚移植。然而由于目前的囊胚培养体系仍不能完全模拟母体生殖道微环境，造成体外培养胚胎质量及发育潜能降低，胚胎发育相对滞后。经过多年的发展，目前人囊胚形成率仅约50％左右，如果全部实行囊胚培养有2％-40％的患者会因胚胎没有发育到囊胚而取消移植。因此，目前单囊胚移植策略尚未能被大多数生殖中心所采纳，改进胚胎体外培养体系提高囊胚形成率和改善囊胚质量对单囊胚移植的普遍开展具有重要的推动作用。而在胚胎体外培养系统中，胚胎培养基是其中最重要的组成部分，培养基的成分对胚胎的生长发育具有关键的作用。大量的动物实验证实，种植前胚胎可以分泌一些细胞因子样物质来调节胚胎的生长发育，多数学者认为这些分泌因子对胚胎发育的明显促进作用主要出现在囊胚形成阶段。已知，分泌型Acrogranin促进囊胚腔的形成与扩张；细胞因子TGF-α和EGF能通过自分泌和旁分泌作用促进囊胚腔的扩张膨大；而在小鼠胚胎培养基中加入外源性TGF-β1可有效提高囊胚形成率、囊胚孵出率和胚胎种植率。尽管近年来，人们通过已发现的一些分泌因子不断改善胚胎培养基，取得了一定的进展，但是提高囊胚形成率和改善囊胚质量的效果并不能令人满意。因此寻找并鉴定更简单、有效的新型胚胎分泌分子改进囊胚培养基，以提高囊胚形成率、改善囊胚质量是辅助生殖研究者一直追求的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM。本专利技术的另一目的是提供该多肽的应用。本专利技术的又一目的是提供一种含有该多肽的囊胚培养基。一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM在制备促进囊胚形成和/或提高囊胚质量的药物或试剂中的应用。本专利技术所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM在制备体外受精-胚胎移植过程中囊胚培养液中的应用。一种囊胚培养液，其特征在于含有所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM。本专利技术所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM在制备体外受精-胚胎移植过程中囊胚质量检测试剂中的应用。一种囊胚质量检测试剂，其特征在于含有所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM。有益效果：胚胎分泌型内源性多肽PDBCM(LGPSVGFDTLRGILISQ)，为HERC2来源肽，由17个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示:①PDBCM来源于HERC2蛋白C端的4378-4394位氨基酸，该区域同样存在于鼠、牛、猪等HERC2蛋白上，所以PDBCM的序列在哺乳动物中高度保守。我们在小鼠囊胚培养液中同样也检测到该肽段的存在；②ProtParam在线分析发现，PDBCM的不稳定系数(Instabilityindex)为38.16，属于稳定型多肽，可稳定存在；脂肪系数(Aliphaticindex)为131.76，平均亲疏水性(Grandaverageofhydropathicity)为0.635，表现为疏水亲脂性，容易通过扩散或胞吞作用进入细胞内；③FITC标记的PDBCM加入合子和2细胞胚胎培养液中，2小时后通过激光共聚焦观察发现荧光分布于合子和2细胞透明带内细胞膜表面，表明PDBCM能够穿过胚胎透明带发挥功能。小鼠胚胎培养液中加入PDBCM，有促进囊胚形成的生物学功能；Pulldown实验证实PDBCM与BIRC6相结合；BIRC6是一种凋亡抑制蛋白，在牛胚胎中通过调节凋亡蛋白降解而促进囊胚形成；PDBCM处理后的小鼠囊胚中BIRC6表达增加、而凋亡蛋白Smac和caspase-9表达降低用，从而促进囊胚形成。因此，PDBCM可以在制备促进囊胚形成和/或提高囊胚质量的药物、制备囊胚培养液中应用。借助PDBCM多肽标准品，我们比较了优质囊胚的培养液与非优质囊胚的培养液中PDBCM的含量，结果发现PDBCM在优质囊胚培养液中含量显著高于非优质囊胚，可见，PDBCM可在制备体外受精-胚胎移植过程中囊胚质量检测试剂中应用。说明书附图图1、胚胎培养液中囊胚形成相关分泌型内源性多肽的基本特征。A：内源性多肽的大小分布；B：内源性多肽的等电点分布；C：内源性多肽的氨基酸数目分布。图2、差异多肽前体蛋白的功能分析图3、6条多肽对小鼠囊胚形成的影响(*P<0.05；**P<0.01vsControl)图4、PDBCM多肽在优质囊胚培养液和非优质囊胚培养液中的含量比较(*P<0.05)。A:PDBCM多肽的质谱图；B:PDBCM多肽在高评分囊胚中含量明显高于低评分囊胚。图5、FITC标记的PDBCM加入胚胎培养液后在小鼠合子和2细胞胚胎上的分布(bar＝20μm)图6、PDBCM对小鼠囊胚形成的影响。A:PDBCM处理后促进小鼠囊胚形成(将2细胞小鼠胚胎放在单个液滴中进行培养，拍照时放到一个液滴进行拍照；)B:与对照组相比，PDBCM处理后形成的囊胚中BIRC6表达升高，而Caspase9和Smac的表达降低。具体实施方式实施例11.1人囊胚培养液中与囊胚形成相关的分泌型内源性多肽的筛选为了避免胚胎间的相互干扰，我们对人卵裂期胚胎进行单胚胎培养，根据囊胚形成的结局分别收集胚胎培养液(分为形成囊胚组和未形成囊胚组)，对形成囊胚的胚胎培养液与未形成囊胚的胚胎培养液进行多肽组学分析。质谱分析结果共计鉴定多肽3228条，其中差异显著的有201条(T-test，P<0.05)。分析发现，这些多肽主要由5-21个氨基酸组成，分子大小在500-2500Da间，PI位于3-10(图1)。1.2差异多肽的蛋白前体功能分析鉴于细胞内源性多肽主要来源于胞内蛋白酶体途径对蛋白前体的降解，因此采用IPA软件，对差异多肽的蛋白前体进行功能分析，结果发现这些蛋白前体的功能涉及细胞黏附、细胞成形、脂质代谢、糖代谢、蛋白水解等，与胚胎发育和植入密切相关(图2)。实施例2多肽PDBCM对小鼠植入前胚胎发育的影响采用化学合成法合成HERC2来源肽即PDBCM，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，对小鼠受精卵进行单胚胎培养，在胚胎培养液(KSOM)中加入不同浓度(2μg/ml、20μg/ml)的PDBCM多肽刺激：取6-8周ICR小鼠，注射PMSG，48h后注射hCG，16h后取材；在显微镜下于输卵管壶腹部取得卵团透明质酸酶消化颗粒细胞，在体外操作液M2中清洗裸卵，放置事先于37度，5％CO2中平衡好的KSOM培养液中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种胚胎分泌型内源性多肽PDBCM，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM在制备促进囊胚形成和/或提高囊胚质量的药物或试剂中的应用。3.权利要求1所述的胚胎分泌型内源性多肽PDBCM在制备体外受精-胚胎移植过程中囊胚培养液中的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：凌秀凤，赵纯，张军强，曹善仁，时晓丹，陈梦茜，王佳怡，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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