一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。本发明专利技术的穿膜肽能够携带功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，到达所需给药的部位，所述的体组织屏障特别是眼屏障。本发明专利技术还提供了包含该穿膜肽的复合体、包含该穿膜肽的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用
本专利技术属于生物制药领域，更具体地，本专利技术涉及一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。
技术介绍
目前，年龄相关性黄斑病变(age-relatedmaculardegeneration，AMD)、糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)等新生血管性眼病已成为主要的致盲性眼病，且其患病率呈上升趋势。此外，许多眼后节疾患如高度近视脉络膜新生血管、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞以及眼前节手术后诱发的黄斑囊样水肿等，也往往严重损害视功能，给患者、患者家庭和社会都带来极大的经济负担。尽管激光和手术治疗可改善或部分保存患者视功能、延缓病情发展，但总体上新生血管性眼病对视功能的损害难以逆转，严重危害患者的视觉质量和生活质量。与激光、手术等治疗方法相比，药物干预是预防和治疗新生血管性眼病的最佳途径，但目前广泛应用的抗血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)重组单克隆抗体或融合蛋白类等药物(Ranibizumab、Conbercept等)，由于其分子量大(分别为48kDa、143kDa)，难以穿透血眼屏障，必须经眼球穿刺至玻璃体腔注射给药，出血、感染、非感染性炎症、血管栓塞、白内障、眼压升高、组织损伤等并发症无法避免。近年来，蛋白质、核酸等生物大分子药物不断涌现，已成为药物研究领域最具划时代意义、最具前景的治疗药物之一。然而，亲水性强和分子量大使得生物大分子药物扩散穿过细胞膜变得十分困难。由此产生了小分子细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPP)、腺病毒载体等功能性分子，应用于增强蛋白质、核酸等药物细胞内递送能力。腺病毒载体在眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的给药中受到了广泛的关注。但已有研究指出，应用重组病毒运送脱氧核糖核酸(deoxynucleotideacid，DNA)表达盒至眼内，同时在眼内过表达治疗性的基因产物，很可能是弊大于利的，且其存在很大的局限性，如转入效率低，细胞毒性大等。本专利技术人所在团队的前期工作中，已经获得了众多抗新生血管活性的多肽(如KV11等)，此外，还有一些抗炎多肽，以及一些神经保护和抗粘连形成多肽等，若能找到适用于携带这些功能肽的引导肽，从而通过无创的方法使得这些小分子功能肽进入眼内，达到持续、稳定、有效治疗湿性AMD、糖尿病黄斑水肿(diabeticmacularedema，DME)、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病的作用，则具有较好的应用价值。综上，亟需找到一种给药方便、可持续给药的药物递送方法，从而能够携带治疗药物有效穿透眼屏障，达到治疗的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种穿膜肽，所述的穿膜肽选自：(a)具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽；(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过1-3个(较佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；(c)与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或(d)包含取自SEQIDNO:1所示氨基酸序列中至少8个连续氨基酸序列的多肽片段。在本专利技术的另一方面，提供所述的穿膜肽或编码该穿膜肽的多核苷酸用途，用于促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，或用于与功能性分子连接来制备能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，或用于制备能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物。在一个优选例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。在另一优选例中，所述的体组织屏障是眼屏障，较佳地所述的眼屏障包括：眼组织屏障(形成眼球壁的各层组织及其各层组织间的细胞连接等)，泪液屏障，血眼屏障(血房水屏障、血视网膜屏障)。在本专利技术的另一方面，提供一种能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，所述的复合体包括：(1)所述的穿膜肽；和(2)与(1)的穿膜肽操作性连接的功能性分子。在一个优选例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。在另一优选例中，所述的功能性多肽包括(但不限于)：抗新生血管生成的多肽，神经保护性多肽，抗粘连形成的多肽；较佳地，所述的抗新生血管生成的多肽包括(但不限于)：KV11。在另一优选例中，所述的穿膜肽与功能性多肽之间，还包括连接肽；较佳地，所述的连接肽是：甘氨酸(如Gly3)或赖氨酸(如Lys1)。在另一优选例中，所述的操作性连接包括：共价连接或非共价连接(如偶联、吸附、结合等)。在本专利技术的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的穿膜肽；或所述的多核苷酸编码所述的能够穿透细胞膜的复合体；且，其中与穿膜肽操作性连接的功能性分子是功能性多肽。在本专利技术的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的穿膜肽，或所述的能够穿透细胞膜或体组织屏障的复合体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞；和药学上可接受的载体。在一个优选例中，所述的药物组合物是预防或治疗眼部疾病的药物组合物，其剂型包括：点眼给药剂型、球结膜下注射剂型、眼周注射剂型、视网膜下注射给药剂型、眼球内给药(例如玻璃体腔内注射)剂型。在另一优选例中，所述的眼部疾病包括(但不限于)：新生血管性眼病(如VEGF引起的血管增生)、退行性眼病、炎症性眼病、肿瘤性眼病、视神经病变性眼病。在本专利技术的另一方面，提供一种注射用给药器(如注射用针)或药盒，所述的注射用给药器或药盒中包括：所述的穿膜肽或所述的编码该穿膜肽的多核苷酸；或所述的能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体；或所述的药物组合物；或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1.M13KEPh.DTM系统DNA图谱及限制性位点。图2.CC12噬菌体克隆的DNA测序图谱(DNA序列：TAGATGTTTACTCCGCCTTCTATGATTGAGCGGCTT)。图3.多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞毒性。**表示P<0.01，***表示P<0.001。图4.FITC标记的多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞内化摄取呈时间依赖性。ARPE-19细胞暴露于250μM浓度的多肽中0.5h，1h，3h，6h后荧光显微镜拍摄的代表性图片。标尺：200μm。图5.A为流式细胞分析定量检测进入ARPE-19细胞内的FITC多肽的荧光强度。B为对于A的结果的统计结果，*表示P<0.05，***表示P<0.001。图6.家兔离体角膜(A)和离体视网膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽选自：(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过1‑3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或(d)包含取自SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少8个连续氨基酸序列的多肽片段。

【技术特征摘要】
1.一种穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽选自：(a)具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或(c)与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或(d)包含取自SEQIDNO:1所示氨基酸序列中至少8个连续氨基酸序列的多肽片段。2.权利要求1所述的穿膜肽或编码该穿膜肽的多核苷酸用途，用于促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，或用于与功能性分子连接来制备能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，或用于制备能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的功能性分子包括：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的体组织屏障是眼屏障，较佳地所述的眼屏障包括：眼组织屏障，泪液屏障，血眼屏障。5.一种能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，其特征在于，所述的复合体包括：(1)权利要求1所述的穿膜肽；和(2)与(1)的穿膜肽操作性连接的功能性分子。6.如权利要求5所述的复合体，其特征在于，所述的功能性分子包括：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。7.如权利要求6所述的复合体，其特征在于，所述的功能性多肽包括：抗新生血管生成的多肽，神经保护性多肽，抗粘连形成的多肽；较佳地，所述的抗新生血管生成的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：许迅，顾健人，陈翀，李宗海，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31