一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。本发明专利技术保护引物对组(序列1至序列28)和记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用。本发明专利技术以血浆作为检测样本，并且针对肺癌相关基因(ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因)设计14对特异性引物，再结合高通量测序的检测方法提高了检测数据量和实验结果准确性，可准确有效地监测肺癌相关基因的突变，该检测方法的灵敏度在0.05％。

Reagent kit for detecting hot spot mutation of lung cancer related gene and application thereof

The invention discloses a kit for detecting hot spots of lung cancer related genes and its application. The invention protects the primer group (sequences 1 to 28) the readability of the carrier and records \whether detecting the lung cancer related gene mutation method\ in preparation for the application kit for detection of lung cancer related gene mutations in the. The present invention in plasma as test samples, and for lung cancer related gene (ALK gene, BRAF gene, EGFR gene and KRAS gene) design 14 pairs of specific primers, combined with high-throughput sequencing detection method improves the detection accuracy of data and experimental results, can accurately and effectively monitor the mutation of lung cancer related genes, the the detection sensitivity of the method in 0.05%.

【技术实现步骤摘要】
一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。
技术介绍
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。随着医学诊断技术特别是分子诊断技术的不断提高，针对肺癌的新的基因不断被发现，基于驱动基因的新型靶向药物不断涌现，肺癌精准治疗成为了关注的热点。肺癌相关基因(ALK，BRAF，EGFR、KRAS和NRAS)的热点突变，有如下：ALK基因的热点突变，涉及1151Tins、L1152R、C1156Y、F1174La、L1196M、G1202R、S1206Y、G1269A等；BRAF基因的热点突变，V600E；EGFR基因的热点突变，涉及G719A、G719C、G719S、A763_Y764insFQEA、T790M、L858R等；KRAS基因的热点突变，涉及G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H等。目前已报道的检测肺癌相关基因突变的方法有：1)直接测序法。用PCR扩增产物进行测序和TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中应用。2)变性高效液相色谱法(DHPLC)。该方法对已知和未知的突变位点均可以检测，灵敏性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认具体位置，最终需要测序确认。3)高分辨率溶解曲线(HRM)是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。4)探针扩增组织突变法(ARMS)。利用引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物的3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。该方法采用优化Taqman探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优化扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1～0.1％左右。这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，不能满足对肺癌检测的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。首先，本专利技术要求保护引物对组和/或记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用；所述肺癌相关基因为ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因。所述引物对组由(1)-(4)所示的特异于ALK基因的4个引物对、(5)所示的特异于BRAF基因的1个引物对、(6)-(12)所示的特异于EGFR基因的7个引物对和(13)-(14)所示的特异于KRAS基因的2个引物对组成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的两个单链DNA组成的引物对1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的两个单链DNA组成的引物对2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的两个单链DNA组成的引物对3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的两个单链DNA组成的引物对4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的两个单链DNA组成的引物对5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的两个单链DNA组成的引物对6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的两个单链DNA组成的引物对7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的两个单链DNA组成的引物对8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的两个单链DNA组成的引物对9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的两个单链DNA组成的引物对10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的两个单链DNA组成的引物对11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的两个单链DNA组成的引物对12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的两个单链DNA组成的引物对13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的两个单链DNA组成的引物对14。所述检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，具体可包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行PCR富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变。步骤(a)中，进行所述PCR扩增时，所述引物对组中的各引物对被分在两组分别进行多重PCR扩增；其中一组中的引物有所述引物对1、所述引物对3、所述引物对5、所述引物对7、所述引物对9、所述引物对11和所述引物对13，另一组中的引物有所述引物对2、所述引物对4、所述引物对6、所述引物对8、所述引物对10、所述引物对12和所述引物对14。两组多重PCR反应的反应体系，各引物均为等摩尔使用。两组多重PCR反应的反应程序，退火温度均为65℃。其中，所述高通量测序可为Illumina测序，具体如NextSeq500测序。其次，本专利技术还要求保护一种用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒。所述肺癌相关基因为ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因。本专利技术所提供的用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中含有前文所述的引物对组。根据需要，所述试剂盒中还可含有前文所述的记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体。另外，为了便于判断所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变，所述试剂盒中还可含有正常人基因组DNA对照品。当然，所述试剂盒中还可含有PCR反应所需的常规试剂。再次，本专利技术还要求保护一种检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法。该方法可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。当该方法为疾病诊断治疗方法时，该方法具体为通过检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变来诊断所述待测者是否患有肺癌。本专利技术所提供的检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，具体可包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行PCR富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变。步骤(a)中，进行所述PCR扩增时，所述引物对组中的各引物对被分在两组分别进行多重PCR扩增；其中一组中的引物有所述引物对1、所述引物对本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物对组和/或记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用；所述肺癌相关基因为ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因；所述引物对组由(1)‑(4)所示的特异于ALK基因的4个引物对、(5)所示的特异于BRAF基因的1个引物对、(6)‑(12)所示的特异于EGFR基因的7个引物对和(13)‑(14)所示的特异于KRAS基因的2个引物对组成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的两个单链DNA组成的引物对1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的两个单链DNA组成的引物对2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的两个单链DNA组成的引物对3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的两个单链DNA组成的引物对4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的两个单链DNA组成的引物对5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的两个单链DNA组成的引物对6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的两个单链DNA组成的引物对7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的两个单链DNA组成的引物对8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的两个单链DNA组成的引物对9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的两个单链DNA组成的引物对10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的两个单链DNA组成的引物对11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的两个单链DNA组成的引物对12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的两个单链DNA组成的引物对13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的两个单链DNA组成的引物对14；所述检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行PCR富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变。...

【技术特征摘要】
1.引物对组和/或记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用；所述肺癌相关基因为ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因；所述引物对组由(1)-(4)所示的特异于ALK基因的4个引物对、(5)所示的特异于BRAF基因的1个引物对、(6)-(12)所示的特异于EGFR基因的7个引物对和(13)-(14)所示的特异于KRAS基因的2个引物对组成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的两个单链DNA组成的引物对1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的两个单链DNA组成的引物对2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的两个单链DNA组成的引物对3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的两个单链DNA组成的引物对4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的两个单链DNA组成的引物对5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的两个单链DNA组成的引物对6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的两个单链DNA组成的引物对7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的两个单链DNA组成的引物对8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的两个单链DNA组成的引物对9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的两个单链DNA组成的引物对10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的两个单链DNA组成的引物对11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的两个单链DNA组成的引物对12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的两个单链DNA组成的引物对13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的两个单链DNA组成的引物对14；所述检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行PCR富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，李巧玲，任爽华，
申请(专利权)人：迈基诺重庆基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50