The invention discloses a quantitative detection method of intestinal microflora of broilers, which comprises the following steps: using fecal genomic DNA extraction kit, the extraction of broiler cecal contents of total DNA in 1.5mLEP tube, the nucleic acid concentration, sterilizing ultrapure water diluted to 20ng/ L, and the solution is preserved in the 20 C refrigerator together, set aside; the synthesis of the intestinal microflora of broilers to construct the intestinal microflora of Broilers PCR primers; plasmid; standard sample detection. The present invention has high specificity, good reproducibility, high sensitivity characteristics; by using the method of specific conserved gene fragment of intestinal flora into vector plasmid construction, improve the accuracy of strain detection, solves the limitations of standard strain as the standard curve; the absolute quantification of intestinal microflora of broilers, can determine the absolute number copy some bacteria, provide a reference for the analysis of intestinal flora diversity and abundance.
【技术实现步骤摘要】
一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法
本专利技术属于于家禽肠道微生物检测
,具体地说,涉及一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法。
技术介绍
动物消化道存在着数目庞大、相对稳定的微生物群落。菌群的多样性能够保证肠道微生物区系平衡。微生物群落能够维持胃肠道环境相对稳定,促进营养物质消化吸收。家禽的大肠很短,食糜会很快进入盲肠,所以盲肠是微生物生存和活动的重要场所。家禽肠道微生物分布,种类和数量的检测方法目前采用两种方法,一种是平板计数法,该法误差大,易污染,检测结果为活菌数,检测效果不好,并且耗时耗劳力。另一种是实时荧光定量PCR法,该方法灵敏度高,污染小,但依赖于标准品,检测菌种选择少,特异性不强。绝对定量PCR(absolutequantificationPCR,AQ-PCR)技术是利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过测定未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度,实现了对测定样本基因的分子拷贝数的绝对定量。目前广泛应用的相对荧光定量PCR技术只是测定样本中的靶序列相对于参照样本量的变化,而不能测出初始模板起始拷贝数的绝对量。标准曲线的制备是绝对荧光定量PCR实验的关键步骤,目前家禽肠道微生物绝对定量PCR法多选择已知菌株为标准品,提取基因组制备标准曲线,测定样品时,标准品与未知样品同时进行PCR循环,根据未知样品的Ct值,结合标准曲线来求得未知样品cDNA的起始拷贝数。该方法会受到标准品的限制,检测菌种选择少,特异性不强,并且标准品菌株是利用平板计数法确定活菌数,存在较大误差。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术针对家禽肠道微生物检测方法目 ...
【技术保护点】
一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1、DNA提取:采用粪便基因组提取试剂盒,将肉鸡盲肠内容物总DNA提取于1.5mLEP管中,测其核酸浓度,灭菌超纯水稀释到20ng/μL,与原液一起保存于‑20℃冰箱,待用;步骤2、合成肉鸡肠道微生物PCR引物;步骤3、构建肉鸡肠道微生物质粒;步骤4、制作标准品;步骤5、进行样品检测。
【技术特征摘要】
1.一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1、DNA提取:采用粪便基因组提取试剂盒,将肉鸡盲肠内容物总DNA提取于1.5mLEP管中,测其核酸浓度,灭菌超纯水稀释到20ng/μL,与原液一起保存于-20℃冰箱,待用;步骤2、合成肉鸡肠道微生物PCR引物;步骤3、构建肉鸡肠道微生物质粒;步骤4、制作标准品;步骤5、进行样品检测。2.根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法,其特征在于,所述步骤3中构建肉鸡肠道微生物质粒具体为:1)以肉鸡肠道内容物总DNA为模板,用步骤1中的引物进行PCR扩增,按照PCR反应体系扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶DNA小量回收试剂盒回收纯化目的片段,测OD值,-20℃保存;2)用试剂盒将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化,按照说明书制备10μL连接混合液,16℃,30min;1μL混合液加入10μLDH5α冰上30min,做一个重复组;42℃热激90s,冰上3min;500μL的LB培养基,37℃,复苏45-60min,220RPM/min;4000RPM/min离心,2min,弃400μL,重悬,LA平板上涂板,37℃过夜培养,不超过16h;3)挑取单菌落白斑,于10uL液体LA培养基中,取1uL进行菌落PCR,剩下的加500uL的液体LA培养基;PCR结果阳性的菌液测序;4)测序结果在blast上比对,阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒;5)质粒测序,NCBI上blast比对结果,挑选与目的菌株匹配的质粒,...
【专利技术属性】
技术研发人员:罗茜,蒋守群,林厦菁,李龙,
申请(专利权)人:广东省农业科学院动物科学研究所,
类型:发明
国别省市:广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。