土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法及其在抗胰腺癌方面的应用技术

本发明专利技术提供了一种菊科旋覆花属植物土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，包括：A、使用提取溶剂对土木香药材渗漉提取，得到提取液；B、将提取液浓缩，加水混悬，用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩，得到土木香乙酸乙酯粗提物；C、土木香乙酸乙酯粗提物进行正相柱层析，用洗脱剂进行洗脱；体外抗胰腺癌活性追踪结合高效液相色谱检识，收集洗脱液，干燥，得到土木香倍半萜内酯有效部位；所述的洗脱剂至少包括由体积比为20～16︰1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂。该方法制备的土木香倍半萜内酯有效部位，生物活性强，操作简单，生产成本低，并且具有质量稳定、可控等优点，可用于胰腺癌治疗药物的制备。

Preparation method of effective part of sesquiterpene lactone and its application in resisting pancreatic cancer

The present invention provides a method, a preparation of effective parts of Compositae Inula plants alantolactone sesquiterpene lactones include: A, the use of solvents on alant medicinal percolation extraction, extracting liquid; B, the extract was concentrated and water suspension, extracted by ethyl acetate extract concentration. Get the ethyl acetate extract of civil incense C, incense; ethyl acetate extracts were civil positive column chromatography with eluent, elution; in vitro anti pancreatic cancer activity tracing combined with HPLC detection, the eluate was dried, obtain the effective parts of alantolactone sesquiterpenoides; the elution agent includes at least the volume ratio of eluent 20~16: petroleum ether and ethyl acetate 1 consisting of. The effective part of the sesquiterpene lactone prepared by the method has the advantages of strong biological activity, simple operation, low production cost, stable quality, controllable, etc., and can be used for the preparation of a medicine for treating pancreatic cancer.

【技术实现步骤摘要】
土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法及其在抗胰腺癌方面的应用
本专利技术属于中药领域，具体是一种土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法及其在抗胰腺癌方面的应用。
技术介绍
菊科(Asteraceae)旋覆花属(InulaL.)植物约有100余种，主要分布于欧洲、非洲及亚洲，以地中海地区为主。我国旋覆花属有20余种和多个变种，其中一部分是广泛分布种；我国的特有种主要集中于西部和西南部。旋覆花属多个种植物常供药用。土木香(InulaheleniumL.)为菊科旋覆花属植物，在我国具有多年用药历史，现被我国2015版药典收载。土木香，味辛、苦、温，归肝、脾经，具有健脾和胃、行气止痛等功效，常用于胸胁、脘腹胀痛，呕吐泻痢，胸胁挫伤，岔气作痛，胎动不安等治疗。土木香含有多个倍半萜内酯类成分，且为其指标性有效成分，2015版药典规定，土木香以干燥品计算，含土木香内酯及异土木香内酯的总和不得低于2.2％。迄今为止，虽然文献报道，对菊科旋覆花属植物进行了较系统的化学成分研究，已从该属多个种的药用植物中，提取、分离得到了一系列倍半萜内酯类化合物，并且鉴定了其化学结构；文献亦报道了多个倍半萜内酯类化合物的多种生物活性，如：驱虫作用，抗菌作用等。但迄今未有对菊科旋覆花属植物中含有的倍半萜内酯类成分的有效部位的研究报道，亦没有提供一种工艺科学合理，有效部位性能稳定、药效物质较明确、生物活性高的土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，及其在临床较难治疗的胰腺癌方面的应用。目前，在提取溶剂及方法方面，文献“土木香化学成分的研究”(赵永明；土木香化学成分的研究；天然产物研究与开发；2009年第21卷)公开了土木香中倍半萜内酯类成分的提取方法，该研究用99％的乙醇回流提取。99％的乙醇在提取土木香脂溶性较强的倍半萜内酯方面具有明显优势，且能最大限度避免极性较大的非倍半萜内酯类杂质的引入，但99％的乙醇成本高，高浓度的乙醇亦不适合工业化生产，存在一定的技术缺陷。文献“土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺”(张乐；土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺；天然产物研究与开发；2015年第27卷)公开了土木香主要倍半萜内酯的提取、纯化方法，包括用95％的乙醇加热回流提取。该法在一定程度上能高效提取出土木香中倍半萜内酯类成分，但回流提取能耗高，且可能对稳定性较差的倍半萜内酯类成分造成破坏，存在一定的技术缺陷。在萃取溶剂及纯化方面，文献“土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺”(张乐；土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺；天然产物研究与开发；2015年第27卷)公开了土木香主要倍半萜内酯的提取、纯化方法，并优化了提取工艺。该方法在纯化主要指标性成分时，未对95％的土木香乙醇提取物进行萃取及粗分离，直接上硅胶柱分离，会引入大量非倍半萜内酯类成分，且影响硅胶的分离效能。硕士论文“治疗IBS有效部位土木香总内酯的制备工艺及质量标准研究”(张乐；上海交通大学，2014级硕士生)公开了土木香总内酯的制备工艺，但其总内酯中包含的倍半萜内酯类成分较多，倍半萜内酯类成分为一类“天然迈克尔反应受体分子”，特别极性较大的该类成分易与体内一些关键蛋白、酶发生不可逆结合，存在潜在毒性，存在一定技术缺陷。在土木香倍半萜内酯有效部位提取方法方面，冷浸法、回流提取法、超临界流体萃取法均有应用。冷浸法提取效率低，提取溶剂用量大；回流提取法可能会造成一些热敏性倍半萜内酯类成分的降解，能耗亦大；超临界流体萃取法提取效率高，但设备昂贵，高压下操作，亦对人员、厂房等要求高，会增加生产成本。在土木香倍半萜内酯纯化工艺方面，硅胶柱层析法应用较多。该法对土木香倍半萜内酯的分离、纯化具有一定优势。文献报道的多是某些倍半萜内酯单体的分离、纯化方法，较少涉及土木香倍半萜内酯有效部位。有文献报道亦提到了利用硅胶柱层析纯化土木香总内酯，但该总内酯成分复杂，药效物质不明确。在土木香倍半萜酯应用方面，文献报道多集中在驱虫、抗菌等方面。其在癌症治疗方面有报道，但以白血病为主，且较多文献报道主要集中在：土木香某倍半萜内酯单体体外对人源肿瘤细胞的生长抑制活性，药效物质明确的土木香倍半萜内酯有效部位，对较难治疗的人源胰腺癌细胞的抑制活性鲜有文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种科学合理，工艺操作简单的菊科旋覆花属植物土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法。所述倍半萜内酯有效部位药效物质明确，纯度高，几个土木香内酯协同，符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的优势及特点，其对胰腺癌的体外抑制活性亦预示其具有重要的应用价值。本专利技术采用的技术方案是：一种土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，所述方法包括：(1)取土木香药材粉碎，过筛，以75～95％(v/v)乙醇水溶液浸泡24～48h后用75～95％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95％乙醇水溶液总用量为土木香药材质量的10～20倍(即乙醇水溶液用量为10～20mL/g土木香药材)；渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。本专利技术采用渗漉法在常温下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏或降解。所用土木香药材为土木香(InulaheleniumL.)的根，被2015版中国药典收载，价廉易得；(2)步骤(1)渗漉液浓缩回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后(即水用量为3～10mL/g浸膏)，再用浸膏3～10倍量(即乙酸乙酯用量为3～10mL/g浸膏)的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到土木香的乙酸乙酯提取物；乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚，能够将土木香提取物中倍半萜内酯类成分萃取完全；乙酸乙酯萃取，亦剔除了土木香醇提物中极性较大的非倍半萜内酯类杂质，且乙酸乙酯毒性较小，工业生产亦符合绿色、环保等理念。(3)乙酸乙酯提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯体积比30～0:1的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比20～16:1的洗脱液。洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的土木香倍半萜内酯有效部位。高效液相色谱检识，及体外抑制胰腺癌活性追踪显示：土木香倍半萜内酯类成分几乎全部位于由体积比为20～16:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得土木香有效部位中倍半萜内酯类活性成分含量更高，分布更加集中，配合常规植化研究，亦明确了该有效部位的药效物质。(4)洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述土木香倍半萜内酯有效部位，该有效部位主要由：土木香内酯、异土木香内酯、alloalantolactone等三个倍半萜内酯类成分组成。优选的，步骤(1)浸泡和渗漉所用溶剂为95％乙醇。该提取溶剂的性质非常适合于提取土木香的根茎和/或根，能够更加高效、完全地获取药用部位中的倍半萜内酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非倍半萜内酯类杂质被提取出来。优选的，步骤(3)所用洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯体积比20～16:1的混合溶剂。本专利技术土木香倍半萜内酯有效部位可与市售或者常用的载体结合，可用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗胰腺癌的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊本文档来自技高网...

【技术保护点】
土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，所述方法包括：(1)取土木香药材粉碎，过筛，以75～95％乙醇浸泡24～48h后，用75～95％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95％乙醇总用量为土木香药材质量的10～20倍；(2)步骤(1)渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后，再用浸膏3～10倍量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到土木香的乙酸乙酯提取物；(3)乙酸乙酯提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，以高效液相色谱检识活性成分，配合抗胰腺癌体外活性追踪实验，收集洗脱液；(4)洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述土木香倍半萜内酯有效部位。

【技术特征摘要】
1.土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，所述方法包括：(1)取土木香药材粉碎，过筛，以75～95％乙醇浸泡24～48h后，用75～95％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95％乙醇总用量为土木香药材质量的10～20倍；(2)步骤(1)渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后，再用浸膏3～10倍量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到土木香的乙酸乙酯提取物；(3)乙酸乙酯提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，以高效液相色谱检识活性成分，配合抗胰腺癌体外活性追踪实验，收集洗脱液；(4)洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述土木香倍半萜内酯有效部位。2.如权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：林能明，张博，阎优优，
申请(专利权)人：杭州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33