用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法，并且具体来说涉及用于通过数据分析检测脱靶位点的方法，所述方法是通过使在体外分离的基因组经历遗传剪刀处理以裂解该基因组，随后对该基因组进行全基因组测序(消化基因组测序)；并且涉及用于使用这种检测方法选择RGEN的靶位点的方法，所述方法将脱靶效应降至最低。本发明专利技术的消化基因组测序可在基因组水平上以高度再现性检测遗传剪刀的脱靶位点，并且因此可用于生产具有高靶特异性的遗传剪刀和所述遗传剪刀的研究。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法
本披露涉及用于检测基因组中可编程核酸酶的脱靶位点的方法，并且具体来说涉及用于通过数据分析检测脱靶位点的方法，所述方法包括通过用可编程核酸酶处理在体外分离的基因组(无细胞基因组DNA)来裂解基因组，然后进行全基因组测序；并且涉及用于使用这种方法选择RGEN的中靶位点的方法，所述方法将脱靶效应降到最低。
技术介绍
来源于II型CRISPR/Cas(规律间隔成簇重复序列/CRISPR相关)原核适应性免疫系统等的可编程核酸酶(例如ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应因子核酸酶)和RGEN(RNA指导的工程化核酸酶))广泛用于培养细胞和完整生物体中的基因组编辑。使用可编程核酸酶的基因组编辑技术是非常有用的技术，其可用于生命科学、生物技术和医学领域中的多种用途。例如，用于种种遗传性或获得性疾病的基因/细胞疗法已通过在干细胞或体细胞中引发靶向遗传修饰而变得可能。然而，可编程核酸酶不仅可使中靶位点突变，还可使与其同源的脱靶位点突变(Nucleicacidsresearch,2013,41(20):9584-9592)。作为代表性例子，包括来源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测基因组中的脱靶位点的方法，其包括：(a)用靶特异性可编程核酸酶裂解分离的基因组DNA；(b)进行该裂解DNA的全基因组测序；和(c)测定通过该测序获得的序列读取中的经裂解位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.24 KR 10-2015-0135702;2014.11.14 US 62/0791.一种用于检测基因组中的脱靶位点的方法，其包括：(a)用靶特异性可编程核酸酶裂解分离的基因组DNA；(b)进行该裂解DNA的全基因组测序；和(c)测定通过该测序获得的序列读取中的经裂解位点。2.根据权利要求1的方法，其进一步包括在该经裂解位点不是中靶位点的情形中，确定该经裂解位点为脱靶位点。3.根据权利要求1的方法，其中该经裂解位点是5'端通过比对所获得的序列读取垂直比对的位点或在5'端图显示双峰图案的位点。4.根据权利要求1的方法，其中该基因组DNA是从表达或不表达该靶特异性可编程核酸酶的细胞中分离的。5.根据权利要求3的方法，其中该比对是通过将该序列读取映射至参考基因组并且随后用BWA/GATK或ISSAAC分析来进行的。6.根据权利要求3的方法，其进一步包括确定两个或更多个对应于沃森链和克里克链的序列读取单独垂直比对的位点为脱靶位点。7.根据权利要求3的方法，其进一步包括确定20％或更多的序列读取经垂直比对并且在该沃森链和克里克链的每一者中具有相同5'端的序列读取的数目为10或更大的位点为脱靶位点。8.根据权利要求1的方法，其中该分离的基因组DNA是从表达可编程核酸酶的细胞中分离的，并且所述方法进一步包括通过在该DNA的脱靶位点处鉴别插缺(插入和缺失)来测定脱靶效应。9.根据权利要求8的方法，其中该插缺是通过使用T7E1分析对该脱靶位点和Cel-I酶进行突变体检测或靶向深度测序来鉴别的。10.根据权利要求1的方法，其中该脱靶位点与该靶位点具有一个或多个核苷酸错配。11.根据权利要求1的方法，其中该脱靶位点与该靶位点具有1至6个核苷酸错配。12.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)是通过在每一经裂解位点处用如下公式计算裂解分数来进行的：Fi：在i位点处开始的正向序列读取的数目Ri：在i位点处开始的反向序列读取的数目Di：在i位点处的测序深度C：任意常数。13.根据权利要求12的方法，其进一步包括在该公式中的常数C为100并且计算分数为25,000或更大时，确定该经裂解位点为脱靶位点。14.根据权利要求1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，金大植，裵相洙，
申请(专利权)人：基础科学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR