本发明专利技术涉及用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法，并且具体来说涉及用于通过数据分析检测脱靶位点的方法，所述方法是通过使在体外分离的基因组经历遗传剪刀处理以裂解该基因组，随后对该基因组进行全基因组测序(消化基因组测序)；并且涉及用于使用这种检测方法选择RGEN的靶位点的方法，所述方法将脱靶效应降至最低。本发明专利技术的消化基因组测序可在基因组水平上以高度再现性检测遗传剪刀的脱靶位点，并且因此可用于生产具有高靶特异性的遗传剪刀和所述遗传剪刀的研究。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法
本披露涉及用于检测基因组中可编程核酸酶的脱靶位点的方法，并且具体来说涉及用于通过数据分析检测脱靶位点的方法，所述方法包括通过用可编程核酸酶处理在体外分离的基因组(无细胞基因组DNA)来裂解基因组，然后进行全基因组测序；并且涉及用于使用这种方法选择RGEN的中靶位点的方法，所述方法将脱靶效应降到最低。
技术介绍
来源于II型CRISPR/Cas(规律间隔成簇重复序列/CRISPR相关)原核适应性免疫系统等的可编程核酸酶(例如ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应因子核酸酶)和RGEN(RNA指导的工程化核酸酶))广泛用于培养细胞和完整生物体中的基因组编辑。使用可编程核酸酶的基因组编辑技术是非常有用的技术，其可用于生命科学、生物技术和医学领域中的多种用途。例如，用于种种遗传性或获得性疾病的基因/细胞疗法已通过在干细胞或体细胞中引发靶向遗传修饰而变得可能。然而，可编程核酸酶不仅可使中靶位点突变，还可使与其同源的脱靶位点突变(Nucleicacidsresearch,2013,41(20):9584-9592)。作为代表性例子，包括来源于酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白和小指导RNA(sgRNA)的RGEN识别23-bp(碱基对)靶DNA序列，所述靶DNA序列由与该sgRNA杂交的20-bp(碱基对)序列和由Cas9识别的5'-NGG-3'前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif，PAM)序列组成，但可容忍多达数个核苷酸序列处的错配(GenomeRes,2014,24:132-141)。另外，RGEN也可裂解与该sgRNA序列相比具有额外碱基序列(DNA凸起)或缺少碱基(RNA凸起)的脱靶DNA序列。同样，ZFN和TALEN二者也可裂解在一些碱基上不同的序列。这表明，在将可编程核酸酶应用于基因组的情形中，除了中靶位点以外，可能还存在大量的脱靶位点。脱靶DNA裂解可导致非预期基因(例如原癌基因和肿瘤抑制基因)突变，以及大范围(gross)基因组重组(例如易位、缺失和倒位)，并且引起在研究和医学中使用可编程核酸酶的严重担忧(ProcNatlAcadSci,2009,106:10620-10625)。就这一点而言，已报道多种策略可降低可编程核酸酶的脱靶效应，尚未报道在整个基因组规模中特异性地作用于中靶位点而没有脱靶效应的可编程核酸酶。为了解决这个问题，必须研发询问可编程核酸酶在基因组规模上的特异性的方法。专利技术概述[技术问题]由于诸位专利技术人尽力研发能在基因组规模上检测并分析可编程核酸酶的靶位点和脱靶位点的系统，已研发出用于通过用可编程核酸酶裂解基因组后进行全基因组测序(WGS)来检测可编程核酸酶的脱靶位点的方法来完成本专利技术(消化基因组测序(Digenome-seq)，核酸酶裂解的基因组DNA测序)。[技术方案]本披露的目的在于提供用于检测可编程核酸酶的脱靶位点的方法，其包括：(a)用靶特异性可编程核酸酶裂解分离的基因组DNA；(b)进行所裂解DNA的全基因组测序；和(c)测定通过该测序获得的序列读取中的经裂解位点。本披露的另一目的在于提供用于在基因组编辑中降低脱靶效应的方法，其包括：使用质粒作为模板将体外转录的指导RNA引入细胞中。[效果]本披露的消化基因组测序可在基因组规模上以高再现性检测出可编程核酸酶的脱靶位点，并且因此可用于生产和研究具有高靶特异性的可编程核酸酶。附图说明图1涉及RGEN介导的体外基因组DNA裂解。(a)其为RGEN介导的体外基因组DNA裂解的模拟图。(b)其鉴别基因组DNA是否被靶向HBB的RGEN在中靶位点和4个潜在脱靶位点处裂解。对于1X反应，使Cas9蛋白(40μg，300nM)和sgRNA(30μg，900nM)与8μgHAP1基因组DNA反应8小时。将Cas9和sgRNA连续稀释10倍到10,000倍。通过qPCR测量未裂解的DNA。(下图)其展示了中靶位点和4个潜在脱靶位点的DNA序列。错配核苷酸以红色显示，并且PAM序列以蓝色显示。(c)其用T7E1分析来测量中靶位点和潜在脱靶位点处由RGEN导致的突变频率。(d)其进行靶向深度测序以测量插缺(indel)频率。图2涉及用于鉴别脱靶位点的RGEN诱导的消化基因组测序。(a)其为用于鉴别脱靶位点的核酸酶裂解的全基因组测序(WGS)的模拟图。将从未转化或经RGEN转化的细胞中分离的基因组DNA通过RGEN裂解，并经历WGS。将序列读取与参考基因组(hg19)比对并使用IGV程序可视化。正向和反向序列读取分别以橙色和天蓝色显示。红色三角形和垂直虚线指示裂解位置。(b)其为使用HBB特异性RGEN在中靶位点处获得的代表性IGV数据。插缺由箭头指示。(c)其显示了根据核苷酸位置具有相同5'端的序列读取的绝对数目和相对数目。图3涉及用于鉴别脱靶位点的RGEN诱导的消化基因组测序。(a-d)其为使用HBB特异性RGEN在潜在脱靶位点OT1(a)、OT3(b)、OT7(c)和OT12(d)处获得的代表性IGV数据。插缺由箭头指示(a)或显示于框中(b)。图4展示了基因组上的特定位置处的5'端数目的图。(a)其显示了核酸酶裂解位点处的IGV数据。(b、c)其展示了显示出在OT1(b)和OT3(c)位点处根据核苷酸位置具有相同5'端的序列读取的绝对数目和相对数目的5'端图。图5展示了通过消化基因组测序鉴别并通过靶向深度测序验证的HBBRGEN的脱靶位点。(a)其为显示出在未转化或经RGEN转化的细胞中通过使用HBBRGEN的消化基因组测序鉴别的中靶位点和脱靶位点的数目的维恩图(Venndiagram)。(b)其展示了比较通过消化基因组测序鉴别的位点与中靶位点的热图。(c)其展示了使用通过消化基因组测序鉴别的位点处的DNA序列通过WebLogo获得的序列标志。(d)其为消化基因组测序和靶向深度测序的结果汇总。N.D.意味着未测得。(e)其展示了通过靶向深度测序验证的脱靶位点。蓝条和红条代表使用未转化HAP1细胞和经HBBRGEN转化的HAP1细胞获得的插缺频率。(左图)其展示了中靶位点和脱靶位点的DNA序列。错配碱基以红色显示，并且PAM序列以蓝色显示。(右图)通过费雪精确检验(Fisherexacttest)计算P值。图6展示了在完整基因组序列中鉴别的假阳性位置。(a-c)其为假阳性位点周围的代表性IGV数据，所述假阳性位点是由于HAP1细胞中天然存在的插缺产生的。图7展示了在新验证的脱靶位点处由HBBRGEN诱导的插缺序列。(a，b)通过靶向深度测序检测脱靶插缺。插入的核苷酸以红色显示并且PAM序列以蓝色显示。图8展示了通过消化基因组测序鉴别的VEGF-ARGEN的脱靶位点。(a)其展示了在一个VEGF-A脱靶位点处的5'端数目的图。(b)其为比较通过消化基因组测序鉴别的位点与中靶位点的热图。深红色和深蓝色对应给定位置处的100％和0％匹配。(c)其展示了使用通过消化基因组测序鉴别的位点处的DNA序列通过WebLogo获得的序列标志。(d)其为消化基因组测序和靶向深度测序的结果汇总。N.D.意味着未测得。(e)其展示了通过靶向深度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测基因组中的脱靶位点的方法，其包括：(a)用靶特异性可编程核酸酶裂解分离的基因组DNA；(b)进行该裂解DNA的全基因组测序；和(c)测定通过该测序获得的序列读取中的经裂解位点。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.24 KR 10-2015-0135702;2014.11.14 US 62/0791.一种用于检测基因组中的脱靶位点的方法，其包括：(a)用靶特异性可编程核酸酶裂解分离的基因组DNA；(b)进行该裂解DNA的全基因组测序；和(c)测定通过该测序获得的序列读取中的经裂解位点。2.根据权利要求1的方法，其进一步包括在该经裂解位点不是中靶位点的情形中，确定该经裂解位点为脱靶位点。3.根据权利要求1的方法，其中该经裂解位点是5'端通过比对所获得的序列读取垂直比对的位点或在5'端图显示双峰图案的位点。4.根据权利要求1的方法，其中该基因组DNA是从表达或不表达该靶特异性可编程核酸酶的细胞中分离的。5.根据权利要求3的方法，其中该比对是通过将该序列读取映射至参考基因组并且随后用BWA/GATK或ISSAAC分析来进行的。6.根据权利要求3的方法，其进一步包括确定两个或更多个对应于沃森链和克里克链的序列读取单独垂直比对的位点为脱靶位点。7.根据权利要求3的方法，其进一步包括确定20％或更多的序列读取经垂直比对并且在该沃森链和克里克链的每一者中具有相同5'端的序列读取的数目为10或更大的位点为脱靶位点。8.根据权利要求1的方法，其中该分离的基因组DNA是从表达可编程核酸酶的细胞中分离的，并且所述方法进一步包括通过在该DNA的脱靶位点处鉴别插缺(插入和缺失)来测定脱靶效应。9.根据权利要求8的方法，其中该插缺是通过使用T7E1分析对该脱靶位点和Cel-I酶进行突变体检测或靶向深度测序来鉴别的。10.根据权利要求1的方法，其中该脱靶位点与该靶位点具有一个或多个核苷酸错配。11.根据权利要求1的方法，其中该脱靶位点与该靶位点具有1至6个核苷酸错配。12.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)是通过在每一经裂解位点处用如下公式计算裂解分数来进行的：Fi：在i位点处开始的正向序列读取的数目Ri：在i位点处开始的反向序列读取的数目Di：在i位点处的测序深度C：任意常数。13.根据权利要求12的方法，其进一步包括在该公式中的常数C为100并且计算分数为25,000或更大时，确定该经裂解位点为脱靶位点。14.根据权利要求1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，金大植，裵相洙，
申请(专利权)人：基础科学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。