用于多重捕获反应的通用阻断寡聚物系统和改进的杂交捕获的方法技术方案

在一些实施方式中，本文提供了用于核酸操作和分析的新型组合物和改进方法，其可用于多重核酸测序。在某些实施方式中，本文提出的新型组合物和方法更具成本效益，更有利于自动化，并且比传统方法更快。本文还提供了新型阻断核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多重捕获反应的通用阻断寡聚物系统和改进的杂交捕获的方法相关专利申请本专利申请要求于2015年10月10日提交的题为“UNIVERSALBLOCKINGOLIGOSYSTEMFORMULTIPLEXEDCAPTUREREACTIONS”，专利技术人名为EricOlivares，并标示为代理人案卷No.055911-0432232的美国临时专利申请No.62/062612，以及于2014年10月10日提交的题为“METHODSOFHYBRIDIZATIONCAPTUREUSINGNUCLEICACIDBAITSFROMPAIRED-ENDSEQUENCING”，专利技术人名为EricOlivares，并标示为代理人案卷No.055911-0432231的美国临时专利申请No.62/062616的权益。前述专利申请的全部内容通过引用并入本文，包括所有文本、表格和附图。
本技术部分涉及核酸操作、分析和高通量测序的组合物和方法。
技术介绍
活生物体(例如动物、植物、微生物、病毒)的遗传信息编码在脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)中。遗传信息是代表核酸的一级结构的一连串核苷酸或修饰核苷酸。生物体的核酸内容(例如DNA)通常称为基因组。在人类中，完整的基因组通常含有位于二十四(24)条染色体上的约30,000个基因。大多数基因编码特定蛋白，其在通过转录和翻译表达后在活细胞内实现特定生物化学功能。许多医学病症是由基因组内的一个或多个遗传变异引起。一些遗传变异可以使个体易患或产生大量疾病例如糖尿病、动脉硬化、肥胖症、各种自身免疫性疾病和癌症(例如结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌)中的任一种。这样的遗传疾病可以由基因组内的一个或多个核苷酸的添加、置换、插入或缺失引起。遗传变异可以通过对通常从多个来源获得的核酸混合物的多重分析识别，例如通过使用下一代测序技术。这样的多重分析通常涉及在分析之前的大量核酸操作，涉及不利于高通量处理的许多不同步骤。此外，现有核酸操作方法通常昂贵、耗时，并且经常存在可以导致样品污染的重大缺陷。本文的组合物和方法提供了相对于现有核酸操作和分析技术的明显改进，其更有利于高通量自动化、更具成本效益、更少耗时和/或提供更少污染风险。
技术实现思路
在一些方面，本文提出了一种用于大规模并行核酸测序的组合物，其包含a)包含多个文库插入物的核酸的文库，其中所述文库的每个核酸包含(i)从四个或更多个样品之一获得的至少一个文库插入物，(ii)第一非天然核酸，和(iii)第二非天然核酸，其中所述第一非天然核酸和所述第二非天然核酸位于所述至少一个文库插入物的相对侧上，并且所述第一非天然核酸包含第一可区分核酸条形码，所述第二非天然核酸包含第二可区分核酸条形码，其中所述第一和第二可区分核酸条形码对于所述四个或更多个样品之一是独特的；和b)四个U阻断核酸，其中(i)第一和第二U阻断核酸配置为与所述第一可区分核酸条形码的相对侧上的所述第一非天然核酸杂交，和(ii)第三和第四U阻断核酸配置为与所述第二可区分核酸条形码的相对侧上的所述第二非天然核酸杂交，和(iii)所述U阻断核酸各自基本上不与所述第一或第二可区分核酸条形码的部分杂交。在某些方面，核酸的文库包含至少八个可区分核酸条形码。在一些方面，组合物还包含一种或多种捕获核酸，其中(i)捕获核酸包含结合对的成员，和(ii)捕获核酸各自配置为与一个或多个文库插入物的亚组特异性杂交。在某些实施方式中，本文还提出了一种分析核酸文库的方法，其包括a)获得包含多个文库插入物的核酸的文库，其中所述文库的每个核酸包含(i)从四个或更多个样品之一获得的至少一个文库插入物，(ii)第一非天然核酸，和(iii)第二非天然核酸，其中所述第一非天然核酸和所述第二非天然核酸位于所述至少一个文库插入物的相对侧上，并且所述第一非天然核酸包含第一可区分核酸条形码，所述第二非天然核酸包含第二可区分核酸条形码，其中所述第一和第二可区分核酸条形码对于所述四个或更多个样品之一是独特的；b)使所述核酸的文库与四个U阻断核酸接触，其中(i)第一和第二U阻断核酸配置为与所述第一可区分核酸条形码的相对侧上的所述第一非天然核酸杂交，和(ii)第三和第四U阻断核酸配置为与所述第二可区分核酸条形码的相对侧上的所述第二非天然核酸杂交，和(iii)所述U阻断核酸各自基本上不与所述第一或第二可区分核酸条形码的部分杂交；和c)使所述核酸的文库与一个或多个捕获核酸接触，所述一个或多个捕获核酸各自包含结合对的第一成员，其中所述一个或多个捕获核酸配置为与所述文库的核酸的亚组特异性杂交；d)捕获所述捕获核酸，从而提供包含所述文库的核酸的亚组的捕获的核酸；e)使所述捕获的核酸在扩增条件下与引物组接触，从而提供扩增子；和f)分析所述扩增子。在某些方面，分析包括提供序列读数。在一些方面，序列读数可以通过包括大规模并行测序和/或双端测序(pair-endsequencing)的方法获得。在关于本文的组合物和方法的某些方面，非天然核酸包含通用核酸。在一些方面，文库的核酸包含四个或更多个、或十个或更多个条形码核酸。在一些方面，每个文库插入物包含一个或两个条形码序列。在某些方面，U阻断核酸包含10至40个核苷酸的长度。在某些方面，U阻断核酸包含10至20个核苷酸的长度。在一些方面，U阻断核酸包含锁核酸和/或桥连核酸。在某些方面，U阻断包含约65℃至约90℃的熔融温度。在某些方面，U阻断核酸包含至少65℃或至少75℃的熔融温度。在一些方面，U阻断核酸不包含简并(degenerate)核苷酸碱基。在一些方面U阻断核酸不包含3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、肌苷、2’-脱氧肌苷、类似物、衍生物或其组合。在一些方面，本文提供了一种分析核酸文库的方法，其包括a)获得包含第一组扩增子的核酸的文库，其中每个扩增子包含第一非天然核酸和第二非天然核酸、一个或多个可区分标识符和从一个或多个样品之一获得的文库插入物，其中文库插入物位于第一和第二非天然核酸之间；b)制备混合物，其包括使文库的核酸与一种或多种阻断核酸和捕获核酸接触，其中(i)一种或多种阻断核酸配置为与第一和第二非天然核酸特异性杂交，(ii)捕获核酸包含结合对的第一成员，和(iii)捕获核酸配置为与第一组扩增子的亚组特异性杂交，c)纯化混合物，从而提供纯化核酸，其中纯化核酸包含文库的核酸，一个或多个阻断核酸和捕获核酸，d)在杂交条件下杂交纯化核酸，e)捕获捕获核酸，从而提供捕获的核酸，f)在扩增条件下将捕获的核酸与引物组接触，从而提供第二组扩增子，以及g)分析第二组扩增子。在一些方面，扩增条件包括热稳定聚合酶和/或聚合酶链式反应。在某些方面，(b)中的制备包括使文库的核酸与竞争者核酸接触。在一些实施方式中，捕获核酸配置为与文库插入物的部分特异性杂交。在某些实施方式中，一个或多个阻断核酸配置为与第一非天然核酸和/或第二非天然核酸的部分特异性杂交。在某些实施方式中，一个或多个阻断核酸包含锁核酸和/或桥连核酸。在一些方面，包含结合对的第一成员的捕获核酸配置为与外显子的部分、内含子、所选染色体的部分和/或包含遗传变异(例如重复、多态性)的DNA区域特异性杂交。在一些实施方式中，结合对的第一成员包含生物素、抗原、半抗原、抗体或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于大规模并行核酸测序的组合物，其包含：a)包含多个文库插入物的核酸的文库，其中所述文库的每个核酸包含(i)从四个或更多个样品之一获得的至少一个文库插入物，(ii)第一非天然核酸，和(iii)第二非天然核酸，其中所述第一非天然核酸和所述第二非天然核酸位于所述至少一个文库插入物的相对侧上，并且所述第一非天然核酸包含第一可区分核酸条形码，所述第二非天然核酸包含第二可区分核酸条形码，其中所述第一和第二可区分核酸条形码对于所述四个或更多个样品之一是独特的；和b)四个U阻断核酸，其中(i)第一和第二U阻断核酸配置为与所述第一可区分核酸条形码的相对侧上的所述第一非天然核酸杂交，和(ii)第三和第四U阻断核酸配置为与所述第二可区分核酸条形码的相对侧上的所述第二非天然核酸杂交，和(iii)所述U阻断核酸各自基本上不与所述第一或第二可区分核酸条形码的部分杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.10 US 62/062,612;2014.10.10 US 62/062,6161.一种用于大规模并行核酸测序的组合物，其包含：a)包含多个文库插入物的核酸的文库，其中所述文库的每个核酸包含(i)从四个或更多个样品之一获得的至少一个文库插入物，(ii)第一非天然核酸，和(iii)第二非天然核酸，其中所述第一非天然核酸和所述第二非天然核酸位于所述至少一个文库插入物的相对侧上，并且所述第一非天然核酸包含第一可区分核酸条形码，所述第二非天然核酸包含第二可区分核酸条形码，其中所述第一和第二可区分核酸条形码对于所述四个或更多个样品之一是独特的；和b)四个U阻断核酸，其中(i)第一和第二U阻断核酸配置为与所述第一可区分核酸条形码的相对侧上的所述第一非天然核酸杂交，和(ii)第三和第四U阻断核酸配置为与所述第二可区分核酸条形码的相对侧上的所述第二非天然核酸杂交，和(iii)所述U阻断核酸各自基本上不与所述第一或第二可区分核酸条形码的部分杂交。2.权利要求1所述的组合物，其中所述核酸的文库包含至少八个可区分核酸条形码。3.权利要求2所述的组合物，其中所述至少八个可区分核酸条形码各自存在于所述文库的不同核酸上。4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二U阻断核酸与所述第一非天然核酸的部分基本上互补，并且所述第三和第四U阻断核酸与所述第二非天然核酸的部分基本上互补。5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其包含不超过四个U阻断核酸。6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸包含基本上相同的核酸序列。7.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸包含基本上不同的核酸序列。8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其包含一个或多个捕获核酸，其中(i)所述捕获核酸包含结合对的成员；和(ii)所述捕获核酸各自配置为与所述文库的核酸的亚组特异性杂交。9.权利要求8所述的组合物，其中所述捕获核酸各自配置为与所述多个插入物的亚组特异性杂交。10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述四个或更多个样品从一种或多种物种获得。11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述四个或更多个样品包含八个或更多个样品。12.权利要求10或11所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸对于所述一种或多种物种的基因组不是内源性的。13.权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸在所述一种或多种物种的基因组中不存在。14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述四个或更多个样品从四个或更多个组织获得。15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述四个或更多个样品从四种或更多种不同哺乳动物获得。16.权利要求15所述的组合物，其中所述一种或多种哺乳动物是人。17.权利要求15或16所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸对于所述四种或更多种不同哺乳动物的基因组不是内源性的。18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述核酸的文库包含十个或更多个可区分核酸条形码。19.权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二可区分核酸条形码具有100％相同的核酸序列。20.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二可区分核酸条形码具有不同且可区分的核酸序列。21.权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述U阻断核酸各自配置为阻断通过聚合酶进行延伸。22.权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸是合成核酸。23.权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸基本上不相同。24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二非天然核酸包含衔接子核酸。25.权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含10至40个核苷酸的长度。26.权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含10至30个核苷酸的长度。27.权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含10至20个核苷酸的长度。28.权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含锁核酸。29.权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含桥连核酸。30.权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含约65℃至约90℃的熔融温度。31.权利要求1至30中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含至少65℃的熔融温度。32.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸各自包含至少75℃的熔融温度。33.权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述第一U阻断核酸和所述第二U阻断核酸基本上相同，并且不同于所述第三U阻断核酸和所述第四U阻断核酸。34.权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四U阻断核酸基本上相同。35.权利要求1至34中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四U阻断核酸基本上不同。36.权利要求2至35中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸与所述至少八个可区分核酸条形码基本上不互补。37.权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸基本上不与可区分核酸条形码杂交。38.权利要求1至37中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸不与可区分核酸条形码的任何部分杂交。39.权利要求1至38中任一项所述的组合物，其包含竞争者核酸。40.权利要求8至39中任一项所述的组合物，其中所述结合对的成员包含生物素、抗原、半抗原、抗体或其部分。41.权利要求40所述的组合物，其中所述结合对的成员包含生物素。42.权利要求1至41中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸是单链。43.权利要求1至42中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸包含链终止子。44.权利要求1至43中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸包含反向重复。45.权利要求1至44中任一项所述的组合物，其中所述核酸的文库包含单链核酸。46.权利要求1至45中任一项所述的组合物，其中所述核酸的文库包含扩增子。47.权利要求1至46中任一项所述的组合物，其中所述多个文库插入物包含基因组核酸。48.权利要求1至47中任一项所述的组合物，其中所述四个U阻断核酸不包含简并核苷酸碱基。49.权利要求48所述的组合物，其中所述简并核苷酸碱基包含3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、其类似物或衍生物。50.权利要求48所述的组合物，其中所述简并核苷酸碱基包含肌苷、2’-脱氧肌苷、其类似物或衍生物。51.一种分析核酸文库的方法，其包括：a)获得包含多个文库插入物的核酸的文库，其中所述文库的每个核酸包含(i)从四个或更多个样品之一获得的至少一个文库插入物，(ii)第一非天然核酸，和(iii)第二非天然核酸，其中所述第一非天然核酸和所述第二非天然核酸位于所述至少一个文库插入物的相对侧上，并且所述第一非天然核酸包含第一可区分核酸条形码，所述第二非天然核酸包含第二可区分核酸条形码，其中所述第一和第二可区分核酸条形码对于所述四个或更多个样品之一是独特的；b)使所述核酸的文库与四个U阻断核酸接...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·奥利瓦瑞斯，
申请(专利权)人：因维蒂公司，
类型：发明
国别省市：美国,US