方法技术

本发明专利技术涉及一种修饰模板双链多核苷酸的方法，特别是使用纳米孔测序进行表征的方法。该方法从模板产生多个经修饰的双链多核苷酸。然后可以表征这些经修饰的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及一种修饰模板双链多核苷酸的方法，特别是使用纳米孔测序进行表征的方法。该方法从模板产生多个经修饰的双链多核苷酸。然后可以表征这些经修饰的多核苷酸。
技术介绍
存在许多需要制备核酸库的商业情况。这通常使用转座酶来实现。根据用于制备所述库的转座酶，在能够使用所述库之前，例如在测序中，可能需要在体外修复转座事件。目前需要在广泛的应用中快速且便宜的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术是缓慢且昂贵的，主要是因为它们依赖于扩增技术来生产大量的多核苷酸，并且需要大量专门的荧光化学品用于信号检测。跨膜孔(纳米孔)具有作为聚合物和各种小分子的直接电生物传感器的巨大潜力。特别是，最近已经重点将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。当跨纳米孔施加电位时，当诸如核苷酸等的分析物瞬间驻留在桶中达一段时间时，存在电流的变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知识别标识(signature)和持续时间的当前的变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链通过孔，得到核苷酸的身份。链测序可涉及使用多核苷酸结合蛋白质来控制多核苷酸通过孔的运动。
技术实现思路
专利技术人惊奇地证明可以修饰模板双链多核苷酸以产生多个更短的经修饰的双链多核苷酸。经修饰的双链多核苷酸可以包括例如发夹环或单链前导序列。这些修饰可以被设计成使得经修饰的双链多核苷酸各自比原始模板多核苷酸更容易表征，例如通过链测序。经修饰的多核苷酸的随后的表征允许更容易确定模板多核苷酸的特征。本专利技术的修饰方法使用MuA转座酶、MuA底物群和聚合酶，并总结在图1中。MuA底物包含相对链上的突出端和发夹环。MuA转座酶能够使模板多核苷酸片段化，并在两端产生具有突出端的片段。MuA转座酶还能够将底物在双链片段的一端或两端连接到突出端。没有突出端的底物的链通常用突出端连接到片段的链上。这在所得双链构建体中留下单链间隙。双链构建体还具有在与间隙相对的链上的发夹环。该聚合酶能够使用包含发夹环的链作为模板并且移位含有单链间隙的链。所得的双链构建体含有包含模板多核苷酸的片段的两条互补链。该构建体中的两条链可以分离，并优选同时用作模板，以产生包含模板多核苷酸的片段的两个双链构建体，其中两条链通过发夹环连接。因此，本专利技术提供了一种修饰模板双链多核苷酸的方法，其包括：(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶和双链MuA底物群接触，双链MuA底物群中的每个包括(i)至少一个突出端和(ii)与包括至少一个突出端的链相对的链中的至少一个发夹环，使得转座酶将所述模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端，并且从而产生多个片段/底物构建体；(b)使所述片段/底物构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶置换包括突出端的链，并用与包括发夹环的链互补的链替换它们，从而产生多个双链构建体，每个所述双链构建体包括模板多核苷酸的双链片段；和(c)分离双链构建体的两条链，并使用所述链作为模板以形成多个经修饰的双链多核苷酸，每个所述经修饰的双链多核苷酸包括由至少一个发夹环连接的两条互补链。本专利技术还提供：-使用本专利技术的方法制备的多个经修饰的双链多核苷酸；-一种用于修饰模板多核苷酸的双链多核苷酸MuA底物群，其中所述底物如以上定义；-一种表征使用本专利技术的方法修饰的至少一种多核苷酸的方法，其包括：a)使经修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得多核苷酸的至少一条链移动通过孔；和b)当至少一条链相对于孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值指示所述至少一条链的一个或多个特征，并从而表征所述经修饰的多核苷酸；-一种表征模板多核苷酸的方法，包括：a)使用本专利技术的方法修饰模板多核苷酸，以产生多个经修饰的多核苷酸；b)使每个经修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得每个多核苷酸的至少一条链移动通过孔；和c)当每个多核苷酸相对于孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值指示每个多核苷酸的一个或多个特征，从而表征模板多核苷酸；以及-一种用于修饰模板双链多核苷酸的试剂盒，其包括(a)如以上定义的MuA底物群，(b)MuA转座酶和(c)聚合酶。附图说明图1示出了修饰模板双链多核苷酸(标记为a)的方法的卡通表示。步骤1涉及使模板双链多核苷酸与MuA转座酶(标记为b)以及双链MuA底物群(标记为c，双链MuA底物均含有5′发夹环)接触，使得MuA转座酶将模板双链多核苷酸片段化，并将MuA底物在分裂点的每一侧插入。步骤2涉及用聚合酶(标记为e)和dNTP处理模板链，dNTP替换标记为d的DNA片段并产生与DNA5′发夹环互补的链。步骤3涉及对标记为f的双链DNA构建体的热处理，使得所述链变性成单链DNA(标记为g)。最后，步骤4涉及形成互补链的DNA聚合酶。图2示出了修饰实施例1中概述的模板双链多核苷酸(标记为a)的方法的卡通表示。步骤1涉及使模板双链多核苷酸与MuA转座酶(标记为b)以及双链MuA底物群(标记为c，双链MuA底物均含有5′发夹环)接触，使得MuA转座酶将模板双链多核苷酸片段化，并将MuA底物在分裂点的每一侧插入。步骤2涉及用聚合酶(标记为e)和dNTP处理模板链，dNTP替换标记为d的DNA片段并产生对于DNA5′发夹环的互补链。步骤3涉及标记为f的双链DNA构建体的热处理，使得所述链变性成单链DNA(标记为g)。步骤4涉及用形成互补链的DNA聚合酶进行的第二次处理。最后，步骤5涉及步骤4中产生的双链DNA构建体的dA-拖尾(dA-tailing)、具有酶(标记为h)预先结合的适配器的连接，以及含有胆固醇系链(标记为j)的DNA链(标记为i)的杂交。这产生了在实施例1中描述的纳米孔系统中被测试的最终DNA构建体。图3示出了当解旋酶(T4Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(SEQIDNO：24具有突变E94C/C109A/C136A/A360C))控制DNA样品6通过MspA纳米孔易位时的示例性电流迹线(y轴坐标＝电流(pA)，x轴坐标＝时间(s))。图4示出了Agilent12,000DNA芯片迹线。标记为1的线是未处理的MuA片段化DNA输入材料，标记为2的线是具有68℃培育步骤(在实施例1的1.2中)的分析物，并且随后经历了实施例1的步骤1.3的全部，标记为3的线在实施例1的步骤1.2中没有68℃培育但是经历了实施例1的步骤1.3的全部。区域X对应于双链DNA库，区域Y对应于Agilent12,000的上标记并且区域Z对应于Agilent12,000芯片的下标记。图5示出了修饰模板双链多核苷酸(标记为a)的优选方法的卡通表示。除了每个底物包含通过间隔基(spacer)(xxx；标记为h)与发夹环分离的前导序列(标记为i)之外，图5与图1相同。引导序列不用作模板，因为聚合酶(标记为e)不能移动通过间隔基。图6示出了当解旋酶(T4Dda-E94C/C109A/C136A/A360C)控制DNA样品7通过MspA纳米孔易位时的示例性电流迹线(y轴坐标＝电流(pA)，x轴坐标＝时间(s))。图7示出了修饰模板双链多核苷酸(标记为a)的方法的卡通表示。步骤1涉及使模板双链多核苷酸与MuA转座酶(标记为b)以及双链MuA底物群(标记为C，其中双链MuA底物均含有5′发夹环，其在替换G/C’s的发夹(标记为h并且显示为黑色圆圈)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰模板双链多核苷酸的方法，包括：(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶以及一群双链MuA底物接触，每个双链MuA底物包括(i)至少一个突出端和(ii)与包括所述至少一个突出端的链相对的链中的至少一个发夹环，使得转座酶将所述模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端，从而产生多个片段/底物构建体；(b)使所述片段/底物构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶置换包括所述突出端的链，并用与包括发夹环的链互补的链替换它们，从而产生多个双链构建体，每个所述双链构建体包括模板多核苷酸的双链片段；和(c)分离所述双链构建体的两条链，并使用所述链作为模板以形成多个经修饰的双链多核苷酸，每个所述经修饰的双链多核苷酸包括由至少一个发夹环连接的两条互补链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.14 GB 1418159.81.一种修饰模板双链多核苷酸的方法，包括：(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶以及一群双链MuA底物接触，每个双链MuA底物包括(i)至少一个突出端和(ii)与包括所述至少一个突出端的链相对的链中的至少一个发夹环，使得转座酶将所述模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端，从而产生多个片段/底物构建体；(b)使所述片段/底物构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶置换包括所述突出端的链，并用与包括发夹环的链互补的链替换它们，从而产生多个双链构建体，每个所述双链构建体包括模板多核苷酸的双链片段；和(c)分离所述双链构建体的两条链，并使用所述链作为模板以形成多个经修饰的双链多核苷酸，每个所述经修饰的双链多核苷酸包括由至少一个发夹环连接的两条互补链。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括通过增加pH、温度和离子强度中的一个或多个来分离所述双链构建体的两条链。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括使分离的链与聚合酶接触，使得所述聚合酶使用所述链作为模板以形成所述多个经修饰的双链多核苷酸。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括(i)使多个分离的链与一群核苷酸寡聚体接触，所述一群核苷酸寡聚体包括在所述寡聚体能够与所述链杂交的条件下与所述链中所有核苷酸互补的核苷酸的每种可能组合，和(ii)将那些与所述链杂交的寡聚体连接在一起以形成所述多个经修饰的双链多核苷酸。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括使所述多个双链构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶同时分离所述双链构建体的两条链，并将所述链用作所述多个经修饰的双链多核苷酸的模板。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个发夹环不连接每个底物的两条链。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个突出端长度为4、5或6个核苷酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个底物包括可选择的结合部分。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个底物包括能够优先螺旋穿过跨膜孔的前导序列。10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括(d)在发夹环的相对端将Y适配器连接到所述多个经修饰的双链多核苷酸，并且其中所述Y适配器任选地包括能够优先螺旋穿过跨膜孔的前导序列。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将一个或多个多核苷酸结合蛋白与所述多个经修饰的双链多核苷酸结合。12.使用根据前述权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·怀特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB