多特异性抗体平台和相关方法技术

本文公开了新的多特异性抗体平台、多特异性抗体和制备所述抗体的方法。通过增加一条链的正电荷和另一条链的负电荷，修饰包含Fc区的多肽链的CH3结构域。使用所述修饰的链共转染中的异二聚体形成与使用野生型多肽转染相同细胞系时野生型抗体的形成是可比较的。此外，所述修饰提供了所述异二聚体的简单的一步纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多特异性抗体平台和相关方法优先权要求本专利申请要求2015年8月26日提交的美国临时申请系列号62/209,978的优先权，且其内容通过提述以其整体并入本文。序列表本申请含有序列数据。专利
本专利技术涉及多特异性抗体平台、多特异性抗体，包括双特异性抗体，和产生它们的方法。专利技术背景抗体是大的糖蛋白，其由B淋巴细胞衍生的浆细胞响应于抗原而分泌。存在五种主要类型的抗体：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。IgG占人体内血清抗体的约75％，且其是存在于循环中的最常见类型的抗体。在所有五种主要类型的抗体中，基本单元是Y形状的单体，其由两条相同的重链(HC)和两条相同的轻链(LC)组成。每条LC具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。每个HC具有一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH)。Y结构中的‘臂’形成抗原结合片段(Fab)。该臂通过柔性铰链区连接至同二聚体Fc片段(可结晶片段)，其形成Y结构的‘底座’。抗体与免疫系统的其它组分通信的能力经由Fc区介导。在哺乳动物细胞系中产生同二聚体Fc区是本领域中已知的。此类同二聚体Fc区可以用于例如将抗体样特性带给融合蛋白。双特异性抗体(BsAb)是人工蛋白，其由两个不同抗体的片段构成，且因此BsAb结合两种不同类型的抗原。双特异性抗体属于多特异性抗体。多特异性抗体可以是双特异性的、三特异性的，或四特异性的抗体。此类多特异性抗体的Fc片段优选是异二聚体。双特异性，以及其它多特异性抗体通常在广泛的临床和诊断应用中显示出巨大的潜力。存在有欧盟和美国批准用于治疗肿瘤疾病的两种双特异性抗体药物(Catumaxomab和Blinatumab)。由于其独特的特征，双特异性和多特异性抗体通常已经分期为对于下一代抗体治疗剂非常有吸引力的形式。在临床研究领域中，已经在几篇出版物中描述了特异性抗体的诊断应用(例如Fanger等人，Crit.Rev.Immunol.1992,12:101-124；Nolan等人，Biochem.Biophys.Acta.1990，1040:1-11；Song-Sivilai等人，ClinExp.Immunol.1990,79:315)。然而，双特异性抗体(BsAb)最令人印象深刻的应用在于免疫-肿瘤领域。理论上，BsAb的一个臂可以结合肿瘤细胞上的肿瘤抗原，BsAb的第二个臂可以结合免疫效应细胞标志物。因此，BsAb可以作为桥接剂(bridgingagent)来募集免疫效应细胞(天然杀伤细胞或效应T细胞)并将其带到局部肿瘤部位以杀死肿瘤细胞。这些治疗应用已经描述于许多出版物中(Hseih-Ma等人，CancerRes.1992,52:6832-6839；Weiner等人，CancerRes.1993,53:94-100；Shalaby等人，J.Exp.Med.1992,175:217；Weiner等人，J.Immunol.1994,152:2385)。制备BsAb或多特异性抗体的几种不同方法是本领域已知的。在20世纪80年代，通过两种不同杂交瘤的交叉杂合体(cross-hybrid)产生双特异性抗体(Millstein和Cello，Nature1983,305：537-539)。由于两种不同重链和两种不同轻链的随机配对，那些杂合的杂交瘤(也称为四源杂交瘤(quadromas))可以产生多达10种不同种类的抗体组合，其中只有一种是所需的BsAb形式。这种情况导致正确的BsAb形式的麻烦和低产率纯化。为了克服随机分类问题，优选产生两个不同修饰的Fc结构域，使得那两个修饰的Fc结构域当它们彼此相遇时能够相对于同二聚体形成有利于异二聚体形成。每个修饰的Fc可以与具有独特结合特异性的Fab或ScFv融合。当具有不同结合特异性的那两种不同修饰的含Fc的片段在哺乳动物细胞培养物中共表达时，它们可以以良好的产率形成异二聚体双特异性抗体。在PCT专利申请公开WO2007/147901和美国专利8,592562中公开了另一种方法，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域的电荷被重新分布，使得那两个不同修饰的CH3结构域相对于同二聚体形成将有利于异二聚体形成。然而，通常在哺乳动物细胞中共表达两种不同的Fc重链可以导致形成一些异二聚体Fc片段，但也导致大量形成同二聚体片段。从共转染的细胞培养物或工程化的稳定细胞系上清液纯化异二聚体片段是麻烦和昂贵的。已经对这个问题进行了一些改进。例如美国专利号5,807,706公开了在CH3结构域上的所谓的“突出-入-穴(knob-into-hole)”突变。通过采用“突出-入-穴”策略，已经公开了几种其它的方法，例如在美国专利申请2014/0348839和2013/0245233中。这种技术导致更高的异二聚体形成，但是一些“穴”同二聚体和“突出”单体仍然存在。美国专利申请号2012/0116057公开了在野生型CH3结构域中，通过优选用丙氨酸取代丝364位丝氨酸来改进异二聚化。这种取代导致异二聚体Fc的聚集增加。在开发治疗组合物中抗体已经变得越来越重要。多特异性抗体衍生物，包括双特异性抗体可以认为是用于癌症治疗的下一代靶向生物制剂。多特异性抗体结合至少两种抗原或表位。多特异性抗体在实验性癌症治疗中的应用包括结合不同细胞表面蛋白以实现更完全阻断增殖或血管发生相关途径的分子。多特异性抗体也可用作载体以将免疫效应细胞递送至肿瘤。因此，多特异性抗体由于其结合多于一种抗原的能力是合乎需要的。然而，制备和纯化多特异性抗体(包括双特异性抗体)，仍然是技术挑战，也非常昂贵。因此，需要新的方法来制备高纯度的此类抗体。各种手段在本领域中是已知的，但是不能解决本文所述的本专利技术解决的所有问题。本专利技术的一个实施例在附图中说明并将在下文中更详细地描述。专利技术概述本专利技术成功地赋予以下期望和有用的益处和目的，等等。本文描述的专利技术提供了新的多特异性抗体(包括双特异性抗体)、新的抗体和抗体衍生物的平台，提供所述抗体的新方法和提供高度纯化的新的多特异性抗体的新方法。本专利技术提供了新的双或多特异性抗体平台以提高两种不同修饰的哺乳动物IgGFc区以及IgA，IgD，IgE和IgMFc区的异二聚化。本专利技术还提供了铰链区域中的任选修饰。本专利技术进一步提供了简化的一步纯化以实现异二聚体的高纯度。本专利技术的一个目的是提供修饰抗体CH3结构域以工程化包含CH3的第一多肽和包含CH3的第二多肽之间的界面用于异二聚化的策略。特别地，通过氨基酸取代将至少两个，优选二至六个，且最优选三至四个带正电荷的氨基酸(例如但不限于精氨酸，赖氨酸或组氨酸)引入第一多肽的界面以增加正电荷。同时，通过氨基酸取代将至少两个，优选二至六个，且最优选三至四个带负电荷的氨基酸(例如但不限于天冬氨酸或谷氨酸)引入第二多肽的互补界面以增加多肽链的负电荷。在两个互补的CH3结构域的界面处的那些不同的修饰推测提供那两条链之间强得多静电吸引力，以促进异二聚体形成而不是同二聚体形成。此外，可以将半胱氨酸分子与带电荷的氨基酸一起引入到两个互补的CH3结构域的两个界面的适当位置，以允许链间二硫键的形成，并进一步加强异二聚体形成。本专利技术的另一个目的是提供生成此类氨基酸取代的方法，使得第一多肽链上引入的带正电荷的氨基酸将位于本文档来自技高网...

【技术保护点】
多特异性异二聚体抗体分子，其包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其中所述第一重链的CH3结构域包含至少两个氨基酸突变，且所述第二重链的CH3结构域包含至少两个氨基酸突变，其中所述第一重链CH3结构域中的至少两个突变是突变为两个带正电荷的氨基酸，且其中所述第二重链的CH3结构域中的至少两个突变是突变为两个带负电荷的氨基酸，且其中所述第一和第二CH3结构域的修饰促进所述两条重链之间的异二聚体的形成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.26 US 62/209,9781.多特异性异二聚体抗体分子，其包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其中所述第一重链的CH3结构域包含至少两个氨基酸突变，且所述第二重链的CH3结构域包含至少两个氨基酸突变，其中所述第一重链CH3结构域中的至少两个突变是突变为两个带正电荷的氨基酸，且其中所述第二重链的CH3结构域中的至少两个突变是突变为两个带负电荷的氨基酸，且其中所述第一和第二CH3结构域的修饰促进所述两条重链之间的异二聚体的形成。2.权利要求1的多特异性抗体分子，其中所述第一和第二重链两者的CH3结构域各自包含2-4个氨基酸突变。3.权利要求1或2的多特异性抗体分子，其中所述第一重链CH3结构域中的突变定位于选自下组的两个或更多个位点：Y391、K392、T393、T394、P395、P396、V397、L398、D399、S400、Q347、V348、Y349、T350、S354、R355、E356、E357、F405、Y407，和K409。4.前述权利要求中任一项的多特异性抗体分子，其中所述第二重链CH3结构域中的突变定位于选自下组的两个或更多个位点：Y391、K392、T393、T394、P395、P396、V397、L398、D399、S400、Q347、V348、Y349、T350、S354、R355、E356、E357、F405、Y407，和K409。5.权利要求1至任一项的多特异性抗体，其中所述第一重链的CH3结构域中的突变是选自下组的取代：Y391K、Y391R、Y391H、K392R、K392H、T393K、T393R、T393H、T394K、T394R、T394H、P395K、P395R、P395H、P396K、P396R、P396H、V397K、V397R、V397H、V397C、L398K、L398R、L398H、D399K、D399R、D399H、S400K、S400R、S400H、Q347K、Q347R、Q347H、V348K、V348R、V348H、Y349K、Y349R、Y349H、T350K、T350R、T350H、F405R、F405K、F405H、Y407R、Y407K，和Y407H。6.权利要求1至5中任一项的多特异性抗体，其中所述第二重链的CH3结构域中的突变是选自下组的取代：Y391D、Y391E、K392D、K392E、T393D、T393E、T394D、T394E、P395D、P395E、P396D、P396E、V397D、V397E、V397C、L398D、L398E、D399E、S400D、S400E、S354D、S354E、R355E、R355D、F405E、F405D、Y407E、Y407D、K409D，和K409E。7.前述权利要求中任一项的多特异性抗体分子，其中所述抗体另外地包括重链多肽的铰链区中的至少一个氨基酸突变。8.权利要求1至7中任一项的多特异性抗体分子，其中所述分子另外地包含非天然氨基酸、抗体药物缀合物，或可检测标记物。9.前述权利要求中任一项的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文军，
申请(专利权)人：比森医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US